乳腺癌間質(zhì)型循環(huán)腫瘤細(xì)胞對術(shù)后微小殘留病灶的評估價值

孔令禹， 辛智芳， 蘇傳付， 劉麗， 谷兆鑫， 郭宗強(qiáng)， 姚宇鋒

乳腺癌是女性最常見的癌癥類型之一，占所有新發(fā)癌癥的16.7%，發(fā)病率逐年上升[1]。目前，手術(shù)依然是早中期乳腺癌主要治療手段，手術(shù)后的綜合治療極大改善了乳腺癌患者的預(yù)后，但仍有30%～40%的乳腺癌患者術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[2]。術(shù)后2～3年的復(fù)發(fā)監(jiān)測、評估至關(guān)重要。手術(shù)可切除已經(jīng)形成實體病灶的腫瘤組織，但仍可能有部分癌細(xì)胞殘存，向周邊部位或淋巴結(jié)浸潤，或隨血液定植至患者機(jī)體其他部位，無法通過手術(shù)清除，也無法通過常規(guī)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)。這些殘存的腫瘤病灶，稱為微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)。MRD是導(dǎo)致乳腺癌遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的重要原因之一[3]。研究顯示，MRD檢測可以比影像學(xué)提前7～9個月[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是指從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落，并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞的總稱。CTC包括間質(zhì)型、上皮型和上皮間質(zhì)混合型等亞型[5]。其中，間質(zhì)型CTC(mesenchymal circulating tumor cell，MCTC)具有較強(qiáng)的腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲潛能，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移監(jiān)測的重要標(biāo)志物[6-8]。本研究對乳腺癌術(shù)前和術(shù)后MCTC進(jìn)行富集檢測，探索MCTC數(shù)量對術(shù)后MRD的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇臨沂市腫瘤醫(yī)院2019年10月至2021年4月期間經(jīng)臨床病理證實為乳腺癌準(zhǔn)備行手術(shù)的治療患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)空芯針穿刺活組織檢查確診為乳腺癌；②未接受任何輔助性治療者；③臨床資料完整；④無其他部位惡性腫瘤；⑤自愿接受術(shù)前和術(shù)后CTC檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前已行腫塊切除活組織檢查者；②患者依從性差，有精神疾病者。本研究經(jīng)臨沂市腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批件號：KY201901)。患者及家屬均簽署知情同意書。共125例入組；年齡 26～73 歲，平均(52.2±10.8)歲；病理分期為T0～Ⅲ期，其中T0期 2例，Ⅰ期 6例，Ⅱ期 69 例，Ⅲ期 48 例。

1.2 方法 入組患者分別在術(shù)前1～2 d與術(shù)后7～10 d，首先使用EDTA抗凝劑真空采血管，采集2 ml外周血，然后更換枸櫞酸鈉抗凝管(ACD抗凝管)采集4～5 ml外周血，作為MCTC富集檢測樣本。使用CytoSorter?間質(zhì)型細(xì)胞檢測試劑盒富集鑒定MCTC。取4 ml待檢標(biāo)本與磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)以1∶1的比例稀釋混勻，密度梯度離心后，分離獲得外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)層，將細(xì)胞沉淀重懸于190 μL細(xì)胞保存液，采用CytoSorter?CTC檢測系統(tǒng)進(jìn)行MCTC富集，使用Nikon-Ti-E型倒置熒光顯微鏡進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果判讀，以MCTC≥1個/4 ml為陽性。

統(tǒng)計患者腫瘤病灶直徑、病理分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、PR表達(dá)、Ki67表達(dá)、HER2表達(dá)、分子分型，以及術(shù)前和術(shù)后MCTC檢測結(jié)果。所有患者術(shù)后隨訪，隨訪截至2022年5月31日或死亡日期。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者M(jìn)CTC檢測結(jié)果 微流控芯片CTC檢測系統(tǒng)結(jié)合細(xì)胞表面波形蛋白(cell surface vimentin, CSV)捕獲抗體，富集檢測乳腺癌患者的MCTC，如圖1所示。

圖1 乳腺癌MCTC免疫熒光染色檢測結(jié)果(免疫熒光染色 ×20) 1A:MCTC陽性的熒光合并圖；1B:細(xì)胞核染色陽性，呈藍(lán)色熒光；1C:MCTC細(xì)胞表面波形蛋白陽性，呈綠色熒光；1D:白細(xì)胞CD45-藻紅蛋白陰性，陽性呈橙色熒光；1E:明場MCTC細(xì)胞形態(tài)

125例乳腺癌患者中，術(shù)前MCTC檢測檢出率為81.6%(102/125)，乳腺癌患者M(jìn)CTC檢出范圍(0～10)個/4ml，平均MCTC檢出數(shù)量(2.3±1.9)個/4 ml。術(shù)后MCTC檢出率為68.8%(86/125)，乳腺癌患者M(jìn)CTC檢出范圍(0～6)個/4 ml，平均MCTC檢出數(shù)量為(1.5±1.4)個/4 ml。手術(shù)治療后MCTC下降減少，術(shù)前、術(shù)后MCTC數(shù)量(P=0.000 2)和MCTC數(shù)量變化(P=0.000 2)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2 乳腺癌患者術(shù)前和術(shù)后MCTC數(shù)量分布(2A)和數(shù)量變化(2B)比較

2.2 乳腺癌術(shù)前術(shù)后MCTC水平與臨床病理特征相關(guān)性分析 術(shù)前MCTC水平與腫瘤直徑、病理分期、T分期、N分期、Ki67表達(dá)、HER2表達(dá)、分子分型有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與患者年齡、ER表達(dá)、PR表達(dá)無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)前不同病理分期乳腺癌MCTC檢測結(jié)果顯示，T0～Ⅰ期患者M(jìn)CTC檢出率為62.5%(5/8)，Ⅱ期患者M(jìn)CTC檢出率為75.4%(52/69)，Ⅲ期患者M(jìn)CTC檢出率為93.8%(45/48)。表1。

術(shù)后MCTC水平與N分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、病理分期、T分期、ER表達(dá)、PR表達(dá)、Ki67表達(dá)、HER2表達(dá)、分子分型無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后不同病理分期乳腺癌MCTC檢測結(jié)果顯示，T0～Ⅰ期患者M(jìn)CTC檢出率為50.0%(4/8)，Ⅱ期患者M(jìn)CTC檢出率為59.4%(41/69)，Ⅲ期患者M(jìn)CTC檢出率為85.4%(41/48)。T0～Ⅰ期、Ⅱ期患者術(shù)后MCTC數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Ⅲ期患者術(shù)后MCTC數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表1。

表1 125例乳腺癌患者術(shù)前和術(shù)后MCTC水平與臨床病理特征統(tǒng)計分析 [例(%)]

2.3 乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素

單因素分析結(jié)果顯示腫瘤病灶直徑越大、病理分期越晚、T分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67高表達(dá)、術(shù)前和術(shù)后MCTC數(shù)量越多的乳腺癌患者，越容易發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)單因素生存分析[例(%)]

Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示，病理分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER2表達(dá)、分子分型、術(shù)前和術(shù)后MCTC數(shù)量是影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立影響因素，見表3。

表3 125例行乳腺癌改良根治術(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)多因素Cox比例風(fēng)險模型

2.4 MCTC對乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響

本組隨訪時間14～32個月，平均隨訪時間(24.6±4.8)個月。術(shù)前、術(shù)后MCTC數(shù)量≥4個/4 ml的乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高于MCTC數(shù)量<4個/4 ml的乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。術(shù)前MCTC檢測診斷乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度分別為64.3%(18/28)、76.3%(74/97)；術(shù)后MCTC檢測診斷乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度分別為100.0%(11/11)、73.7%(84/114)。

注：術(shù)前和術(shù)后均以MCTC=4個/4 ml為截斷值圖3 術(shù)前(3A)和術(shù)后(3B)MCTC數(shù)量對乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存期的影響分析

3 討論

乳腺癌術(shù)后MRD與腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。更早更準(zhǔn)地篩選出治療后復(fù)發(fā)高?；颊撸翘岣咴缙谌橄侔┲委熀笊娴年P(guān)鍵。既往基于影像學(xué)隨訪方式復(fù)發(fā)監(jiān)測評估無法前瞻性精準(zhǔn)預(yù)測，隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的臨床檢測具有廣泛的應(yīng)用價值，獲取檢測標(biāo)本的非侵襲性、突破腫瘤的時空異質(zhì)性等特點，賦予其廣闊的研究價值和臨床應(yīng)用前景。有研究結(jié)果表明[11]， CTC計數(shù)可以檢測出三陰性乳腺癌患者新輔助化療后的微小殘留病變，并準(zhǔn)確預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，單獨使用CTC診斷患者M(jìn)RD的敏感性為62.0%。目前，使用CTC進(jìn)行乳腺癌術(shù)后MRD評估的臨床研究比較少，動態(tài)監(jiān)測術(shù)前和術(shù)后CTC水平可準(zhǔn)確預(yù)測乳腺癌疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展，對術(shù)后實時了解患者病情具有重要意義[12]。目前，國內(nèi)外關(guān)于MCTC輔助乳腺癌手術(shù)治療復(fù)發(fā)監(jiān)測臨床應(yīng)用研究報道非常少。Jin等[13]使用CytoSorter CTC監(jiān)測技術(shù)平臺研究證實術(shù)前上皮型CTC檢測可以識別出早期復(fù)發(fā)風(fēng)險較高的乳腺癌患者，上皮型CTC≥4個/4 ml的患者的兩年無復(fù)發(fā)生存率(recurrence free survival, RFS)和遠(yuǎn)期無復(fù)發(fā)生存率(distant recurrence free survival, D-RFS)分別為85.2%和88.9%，該研究的樣本量比較少。本研究使用間質(zhì)型CTC探索乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)性，對125例行手術(shù)治療的乳腺癌進(jìn)行MCTC檢測，結(jié)果顯示，入組乳腺癌患者的復(fù)發(fā)率為32.8%(41/125)。無論術(shù)前，還是術(shù)后，MCTC數(shù)量≥4個/4 ml的乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率顯著高于MCTC數(shù)量<4個/4 ml的乳腺癌患者(P<0.001)。術(shù)前MCTC檢測診斷乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度分別為64.3%(18/28)、76.3%(74/97)；術(shù)后MCTC檢測診斷乳腺癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度分別為100.0%(11/11)、73.7%(84/114)。術(shù)前MCTC評估MRD的敏感性與既往研究相似[11]，但術(shù)后MCTC可能更準(zhǔn)確預(yù)測MRD和乳腺癌復(fù)發(fā)。甘潔文等[14]對已完成根治性手術(shù)的患者120例早中期乳腺癌患者進(jìn)行CTC檢測，術(shù)后CTC檢出率為75.0%(90/120)，CTC檢測診斷乳腺癌患者根治手術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度分別為89.5%、97.0%，CTC陽性乳腺癌患者根治手術(shù)后復(fù)發(fā)率均高于CTC陰性者(P<0.05)，與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實間質(zhì)型CTC檢測可能輔助乳腺癌MRD評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測。

影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素很多，趙港美等[15]選取305例行改良根治術(shù)的乳腺癌患者進(jìn)行近3年的隨訪調(diào)查，乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率為34.1%(104/305)，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素包括腫瘤直徑、TNM分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、PR表達(dá)等。張勇等[16]研究結(jié)果顯示，155例行乳腺癌改良根治術(shù)患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)為31.6%(49/155)，單因素和多因素Logistic回歸模型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴有脈管癌栓、原發(fā)腫瘤直徑≥5 cm、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4枚、TNM分期為Ⅲ期、組織學(xué)分級Ⅲ級及激素受體(ER、PR)陰性是乳腺癌改良根治術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險預(yù)測因素(P<0.05)。本研究對125例行手術(shù)治療的乳腺癌患者單因素分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率為32.8%(41/125)，腫瘤病灶直徑越大、病理分期越晚、T分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67高表達(dá)、術(shù)前和術(shù)后MCTC數(shù)量越多的乳腺癌患者越容易發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)。Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示，影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的因素包括病理分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER2表達(dá)、分子分型、術(shù)前和術(shù)后MCTC數(shù)量。本研究結(jié)果與既往國內(nèi)乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)研究結(jié)果基本一致。同時本研究還顯示，術(shù)前和術(shù)后MCTC是乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子(P<0.001)。乳腺癌患者術(shù)后仍具有較高的復(fù)發(fā)率，且影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)的因素較多，應(yīng)根據(jù)這些高危因素，進(jìn)行隨訪和干預(yù)，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。

綜上所述，本研究采用的CSV抗體結(jié)合微流控納米芯片的MCTC富集檢測技術(shù)，在乳腺癌患者術(shù)后MRD評估中具有較好的臨床應(yīng)用價值，乳腺癌患者外周血MCTC檢測有助于動態(tài)監(jiān)測患者的疾病發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外MRD評估，多采用循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)基因測序方法，其檢測敏感度50.0%左右[17]，而且其檢測周期較長，檢測費用昂貴，需要不同時間點多次檢測，不適宜臨床全面開展MRD評估。將ctDNA測序和CTC計數(shù)結(jié)合起來可能更準(zhǔn)確檢測MRD，更準(zhǔn)確預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，兩者聯(lián)合敏感度可達(dá)90.0%以上[11，18]。為更好地探索MCTC檢測在乳腺癌患者M(jìn)RD評估中的應(yīng)用價值，本研究尚需要進(jìn)行多中心和大樣本量臨床研究，同時延長隨訪時間。相信未來MCTC檢測能夠為乳腺癌患者的MRD評估和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測等提供充足的判斷依據(jù)。