LC-MS/MS法測定麻黃-桂枝藥對中11個成分及其溶出影響的探討

衛(wèi)平，鄧小玉，黃蓓，陳劍平，李一圣

(1.深圳市坪山區(qū)婦幼保健院<南方醫(yī)科大學(xué)坪山總醫(yī)院>，廣東 深圳 518118；2.深圳市中醫(yī)院，深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；3.深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院<深圳市耳鼻咽喉研究所>，廣東 深圳 518172)

麻黃為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)或木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的干燥草質(zhì)莖，具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的功效[1]。桂枝為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)的干燥嫩枝，具有散寒解表、溫通經(jīng)脈、促陽化氣之功[1]。麻黃-桂枝藥對出自《傷寒論》，在麻黃湯、大青龍湯等諸多經(jīng)典方劑中常作為君藥、臣藥應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明[2-5]，麻黃中生物堿類、苯丙素類等成分對感冒、咳嗽、心血管和免疫系統(tǒng)疾病等具有治療作用；桂枝中苯丙素類具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗血小板聚集等作用。桂枝與麻黃配伍后，解熱鎮(zhèn)痛、抗炎作用增強(qiáng)，不僅如此，桂枝、麻黃配伍后能提高生物利用度，桂枝能拮抗麻黃引起的興奮性中樞神經(jīng)毒性，降低了麻黃生物堿的蓄積，起到減毒的作用[6-8]。

藥對是中藥配伍應(yīng)用的重要模式，常作為藥物組成方劑的核心，具備復(fù)方的基本功能主治和療效[9]。中藥配伍使用后產(chǎn)生助溶、沉淀、化學(xué)反應(yīng)等現(xiàn)象，以及煎煮等因素的影響，有效成分溶出率發(fā)生變化，對臨床療效也可產(chǎn)生影響[10-11]。近年來，關(guān)于中藥配方顆粒(以單味中藥飲片為原料精制而成)“單煎合同”與傳統(tǒng)湯劑“群藥合煎”的物質(zhì)基礎(chǔ)一致性一直是大眾比較關(guān)注的問題[12-13]。本試驗建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定8個苯丙素類成分(原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛)和3個麻黃類生物堿(麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿)的含量，考察麻黃桂枝共煎、單煎及單煎合并液中11個成分的變化，以期探索共煎及單煎合并對其主要成分的溶出影響，為該藥對的配伍物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-MS8045型液質(zhì)聯(lián)用儀(島津公司，配備DGU-20A3R在線脫氣機(jī)，LC-20ADXR梯度泵、SIL-20AXR自動進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，LCMS-8 045檢測器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，F(xiàn)CV-20AH2高壓切換閥，LabSolutions色譜工作站)；EP225SM-DR型十萬分之一分析天平(瑞士普利塞斯公司)；A3S-10-10-CE型超純水機(jī)(美國艾科浦公司)；LD5-2A型離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超室儀器有限公司)；手動移液器(Eppendorf公司)。

1.2 藥物與試劑 麻黃飲片(康美藥業(yè)股份有限公司，批號：201000051)；桂枝飲片(中山市正德香中藥飲片有限公司，批號：202011068)，經(jīng)深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室陳劍平副主任中藥師鑒定，分別為麻黃科草本狀小灌木草麻黃(EphedrasinicaStapf.)的草質(zhì)莖和樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)的干燥嫩枝，符合《中國藥典》2020年版(一部)項下規(guī)定；其中麻黃產(chǎn)自內(nèi)蒙古，桂枝產(chǎn)自廣東。

肉桂酸(批號：110786-201604，98.8%)、桂皮醛(批號：110710-202022，99.5%)、兒茶素(批號：110877-20164，99.2%)、表兒茶素(批號：110878-201703，99.7%)、原兒茶酸(批號：110809-201906，97.7%)、鹽酸麻黃堿(批號：171241-201809，100.0%)、鹽酸偽麻黃堿(批號：171237-201510，99.8%)和鹽酸甲基麻黃堿(批號：171247-201502，99.6%)購自中國食品藥品檢定研究院；肉桂醇(批號：wkq21030503，HPLC≥98%)和香豆素(批號：wkq21030 207，HPLC≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司；丁香醛(廣州市齊云生物科技有限公司，批號：200910，HPLC≥98%)；乙腈和甲醇(質(zhì)譜級，Merck公司);甲酸(質(zhì)譜級，賽默飛公司);超純水(由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 苯丙素類成分：精密稱取原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛對照品適量，加入乙腈超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.786 5、1.319 4、1.532 1、0.625 3、1.395 0、1.746 3、0.894 1、5.392 8 mg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入乙腈至刻度，即得原兒茶酸(0.707 4 μg·mL-1)、兒茶素(18.471 6 μg·mL-1)、表兒茶素(15.321 0 μg·mL-1)、丁香醛(0.313 0 μg·mL-1)、香豆素(3.906 0 μg·mL-1)、肉桂醇(8.732 0 μg·mL-1)、肉桂酸(14.305 6 μg·mL-1)、桂皮醛(64.713 6 μg·mL-1)的混合對照品溶液。

麻黃生物堿類：精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿對照品適量，加入甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為2.075 0、1.379 7、1.683 2 mg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入甲醇至刻度，即得麻黃堿(17.928 0 μg·mL-1)、偽麻黃堿(8.828 8 μg·mL-1)、甲基麻黃堿(2.155 5 μg·mL-1)的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 麻黃-桂枝共煎液稱取麻黃90 g，加水2 400 mL，浸泡30 min，先煎煮20 min，放入桂枝60 g，繼續(xù)煎煮30 min，保持微沸，過濾，放冷，定容至2 000 mL，即得。

麻黃單煎液：稱取麻黃90 g，加水2 400 mL，浸泡30 min，煎煮50 min，保持微沸，過濾，放冷，定容至2 000 mL，即得。

桂枝單煎液：量取水2 400 mL，煮沸，放入桂枝60 g，繼續(xù)煎煮30 min，保持微沸，過濾，放冷，定容至2 000 mL，即得。

單煎合并液：分別量取麻黃、桂枝單煎液各1 000 mL，混勻，即得。

供試品溶液：精密量取各煎液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得以上各供試品溶液。

2.2 色譜條件

2.2.1 苯丙素類成分 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)；流動相：乙腈(A)-0.01%甲酸水溶液(B)，0～20 min，5%→55%(A)；流速：1.0 mL·min-1，分流比為0.4；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2.2 麻黃類生物堿 色譜柱：Waters Xselect HSS T3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～20 min，3%→8%(A)；20～25 min，8%→20%(A)；流速：1.0 mL·min-1，分流比為0.4；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，正負(fù)離子(苯丙素類生物堿)、正離子(麻黃生物堿類)，霧化氣流量為3.0 L·min-1，干燥氣流量為10.0 L·min-1，加熱氣流量為10.0 L·min-1，檢測器電壓為1.88 kV，檢測離子及主要參數(shù)見表1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，供試品溶液各2 μL，按“2.2”和“2.3”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分色譜峰峰形良好且實現(xiàn)基線分離。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項下各單一對照品儲備液，用甲醇(麻黃生物堿類)或乙腈(苯丙素類)稀釋配制為梯度濃度的混合溶液，按照“2.2”和“2.3”項下條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。

2.4.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下的供試品溶液，按“2.2”和“2.3”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果，原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的RSD(n=6)分別為2.24%、3.15%、2.50%、3.27%、1.68%、2.42%、2.21%、1.50%、2.51%、2.64%、0.80%，均小于5.0%，表明本方法的精密度良好。

表1 各成分質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下的供試品溶液，按“2.2”和“2.3”項下條件分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果，原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的RSD(n=5)分別為、6.78%、4.69%、6.24%、3.35%、3.19%、5.75%、1.63%、4.28%、3.33%、2.99%、4.60%，均小于5.0%，表明供試品溶液在室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.2”和“2.3”項下條件進(jìn)樣測定，測定含量并計算RSD。結(jié)果，原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的平均含量分別為1.125 1、38.375 5、25.131 1、0.711 0、9.112 0、17.873 8、23.327 1、111.025 4、165.616 0、76.082 5、18.163 0 μg·mL-1，RSD(n=6)分別為3.89%、3.54%、2.79%、4.64%、1.44%、1.92%、1.61%、1.81%、0.83%、1.32%、1.42%，均小于5.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取9份已知含量的樣品0.5 mL，按質(zhì)量比0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入各對照品適量，平行3份，按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，并按“2.2”和“2.3”項下條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿的加樣回收率分別為99.03%、100.38%、98.27%、100.92%、100.12%、96.76%、98.60%、102.18%、99.57%、101.77%、100.86%，RSD(n=9)分別為5.19%、2.55%、4.81%、4.65%、3.38%、1.40%、3.65%、1.97%、5.19%、2.55%、4.81%。

表2 11個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍

2.5 含量測定 按“2.1.2”項下方法制得各批次供試品溶液(平行5份)，按“2.2”和“2.3”項下條件進(jìn)樣測定。記錄峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及定容體積折算等計算出麻黃-桂枝共煎液、麻黃單煎液、桂枝單煎液和單煎合并液中原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、丁香醛、香豆素、肉桂酸、肉桂醇、肉桂醛、麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果

由表3可知，與單煎合并液相比，麻黃與桂枝共煎后，原兒茶酸、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛的含量均有不同程度的下降，降幅為11.69%～38.63%；另原兒茶酸、肉桂酸單煎合并后與各自單煎液測定結(jié)果的和無顯著性差異，香豆素、肉桂醇和桂皮醛單煎合并后與各自單煎液測定結(jié)果的和以及桂枝單煎液無顯著性差異。說明以上溶液在混合時，溫度對以上成分的溶出存在一定的影響作用。與單煎合并液相比，麻黃與桂枝共煎后，兒茶素的含量有很大程度的增高，增幅為37.94%，而表兒茶素的含量則無明顯的變化。不管是單煎合并還是共煎，丁香醛、兒茶素和表兒茶素的含量比麻黃桂枝各自單煎液測定值的和均有所下降，表明麻黃與桂枝合并使用均降低該3種成分的含量。與單煎合并液相比，麻黃與桂枝共煎后，麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿的含量均有不同程度的增高，增幅為18.84%～41.10%。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本研究曾嘗試同時測定苯丙素類和麻黃生物堿類成分，但由于麻黃堿類成分的檢測條件為正離子掃描模式，在流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時，各色譜峰的分離度、峰形均較好，將流動相改為乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液后，各色譜峰均不成峰形，分離度也不理想；而苯丙素類成分中肉桂酸的檢測條件為負(fù)離子掃描模式，且對流動相體系的pH值敏感，在流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時，色譜峰檢測不到，未有響應(yīng)值。當(dāng)流動相更換為乙腈-水溶液時，原兒茶酸、肉桂酸和丁香醛的色譜峰的峰形均不理想；流動相更換為乙腈-1 mmol·L-1乙酸銨水溶液時，桂皮醛的響應(yīng)值偏低。另外本研究還分別考察了Waters Xselect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,3 μm)2種規(guī)格色譜柱，采用Waters Xselect HSS T3色譜柱時，原兒茶酸、肉桂酸2個色譜峰的峰形不理想，采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱時，各色譜峰的分離度、峰形均較好，故最終分別建立了苯丙素類成分和麻黃生物堿類成分的測定方法。

由于桂皮醛不穩(wěn)定，暴露于空氣中易發(fā)生氧化，本研究曾用甲醇溶解桂皮醛對照品，于常溫和4 ℃條件放置一段時間后，純度均降低，在LC-MS/MS中可明顯檢出肉桂酸和其他雜質(zhì)峰。當(dāng)采用乙腈溶解時，其穩(wěn)定性較好，24 h內(nèi)未見有分解現(xiàn)象，因此最終選用乙腈溶解。本課題組前期建立苯丙素類成分的含量測定方法時，分別采用乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液為流動相，丁香醛、原兒茶酸和肉桂酸在乙腈-0.01%甲酸水溶液為流動相時，峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度好，故最終選擇乙腈-0.01%甲酸水溶液作為苯丙素類成分測定的流動相。

3.2 溶出影響探討 與麻黃單煎和桂枝單煎測定結(jié)果的加和相比，共煎條件下8種苯丙素類成分的溶出均呈現(xiàn)不同程度的降低，而在單煎合并條件下，除兒茶素、表兒茶素和丁香醛的溶出有降低外，其余5種成分的含量變化無顯著性差異。推測在兩藥煎煮后混合的過程中，溫度對8種苯丙素成分的溶出存在一定的影響。與共同煎煮相比，單煎后合并有利于原兒茶酸、丁香醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛的溶出，抑制了兒茶素的溶出，對表兒茶素的溶出則無顯著性影響。

麻黃桂枝單煎合并液中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的含量相較于單煎液而言，含量下降，推測簡單的合并后，麻黃生物堿與苯丙素類酸性成分酸堿反應(yīng)形成復(fù)鹽，導(dǎo)致含量降低[14]，而共煎后的麻黃生物堿等含量較麻黃單煎液中的含量有了升高，升幅在8.51%～16.45%；另本研究還對去甲基麻黃堿和去甲基偽麻黃堿進(jìn)行了測定，測定的色譜條件同其他麻黃生物堿，由于未購買到該兩種成分的對照品，暫未進(jìn)行定量，峰面積結(jié)果顯示，該兩種生物堿的含量變化趨勢與以上檢測的3種麻黃生物基本一致。推測與桂枝共煎時，雖然與苯丙素類成分形成復(fù)鹽，但桂枝中的某些成分可能促進(jìn)生物堿類等成分更多溶出，具體反應(yīng)途徑亟待研究。麻黃和桂枝配伍共煎使用，對苯丙素類成分的溶出有一定的抑制作用，推斷可能兩者成分中的生物堿類與苯丙素類之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成了復(fù)鹽，導(dǎo)致含量降低。

中醫(yī)不傳之密在于量，因此配伍后效應(yīng)成分的變化對其主治病癥有很重要的影響。本研究建立的8種苯丙類成分和3種麻黃生物堿的LC-MS/MS含量檢測方法，簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，為其臨床應(yīng)用和開發(fā)研究提供參考。