髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料和血管內(nèi)皮生長因子對兔股骨頭壞死血管修復(fù)和微循環(huán)的影響

呂亞軍 任立中 李軍 張海靜 張志坤

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨二科（石家莊 050031）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ON?FH）具有較高的致殘率，影響患者的生活水平[1-2]。ONFH可減弱血管再生和新骨形成，并增強(qiáng)死骨吸收[3-4]。髓芯減壓是一種廣泛認(rèn)可的治療方法，可降低骨內(nèi)壓力，延緩ONFH的進(jìn)程[5]。然而，乙醇濫用、激素濫用、骨壞死損傷的位置和范圍等因素可影響髓芯減壓治療效果[5]。髓芯減壓所形成的空腔需要植骨來完成。天然骨是髓芯減壓后植骨的主要材料，但是天然骨伴有供區(qū)損傷、植骨量不足、不能制備特殊形狀等缺點(diǎn)，限制其臨床應(yīng)用。膠原基骨修復(fù)材料與天然骨的成分幾乎一致，該材料是利用仿生原理由低結(jié)晶度納米級羥基磷灰石與膠原自組裝而成[6]。其他文獻(xiàn)表明，膠原基骨修復(fù)材料具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力及無免疫原性、可降解、易塑形等特性，可加速骨修復(fù)過程[6]。血管再生在骨形成和修復(fù)中至關(guān)重要[7]，血管再生有利于骨痂形成和骨改造塑形。在骨缺血性壞死的修復(fù)過程中，可利用各種細(xì)胞因子來促進(jìn)修復(fù)過程中的血管再生及新骨形成。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種促進(jìn)血管生成的最重要的細(xì)胞因子[7-8]。VEGF可直接吸引內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)骨形成和修復(fù)[9-11]。故本實(shí)驗(yàn)以兔為研究對象，采用股骨頭注入無水乙醇方法造ONFH模型，創(chuàng)新性地結(jié)合髓芯減壓、膠原基骨修復(fù)材料、VEGF探討其對兔ONFH模型血管修復(fù)和微循環(huán)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物30只6月齡無特定病原體級家兔購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄不限，合格證號為SCXN（冀）2013?1?003；體質(zhì)量：（2.21 ± 0.29）kg。這些家兔飼養(yǎng)在12∶12 h的光明?黑暗周期中，室溫設(shè)定為25℃，相對濕度設(shè)定為60%。不限制進(jìn)食和飲水。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會通過，許可號為20141004。

1.2 動物模型建立及磁共振成像掃描篩查參考文獻(xiàn)方法建立ONFH兔模型[12]。采用20 g/L的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈麻醉家兔，成功后將家兔俯臥位固定，剪除兔毛，雙髖部采用1%的活力碘進(jìn)行消毒。在大轉(zhuǎn)子外側(cè)將筋膜和皮膚剪開，并將轉(zhuǎn)子間的肌肉進(jìn)行鈍性分離，X線引導(dǎo)下穿刺至股骨頭中心，之后采用3.0、2.5、2.0 mm直徑的克氏針依次擴(kuò)髓，之后形成骨髓孔道后（圖1A），通過骨穿針套將1 mL的無水乙醇按照0.1 mL/min的速度注射至股骨頭中心（圖1B）。用醫(yī)用骨蠟對皮質(zhì)骨孔洞進(jìn)行封閉，之后將肌肉、筋膜和皮膚進(jìn)行逐層縫合。造模后將家兔在空調(diào)房（28℃）中觀察1 d后放回籠養(yǎng)。6周后進(jìn)行磁共振成像（MRI）掃描。MRI顯示T1WI呈不規(guī)則低信號，T2WI呈不規(guī)則高信號，提示造模成功[13]。

圖1 兔股骨頭鉆孔Fig.1 Drilling the femoral head of the rabbit

1.3 動物分組和治療將30只家兔隨機(jī)分為健康對照組（A組）、模型組（B組）、髓芯減壓+自體松質(zhì)骨組（C組）、髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料組（D組）和髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF組（E組），每組6只，按照相應(yīng)的治療方法對家兔進(jìn)行分組治療。所有家兔取俯臥位，采用40 mg/kg的硫噴妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，于髖關(guān)節(jié)后側(cè)進(jìn)行切口，從闊筋膜張肌與臀大肌之間進(jìn)入，將外旋肌群切斷，同時(shí)將關(guān)節(jié)囊暴露，外旋股骨，將股骨頭顯露出來，髖關(guān)節(jié)不脫位，圓韌帶不切斷，將周圍組織保護(hù)起來，對股骨頭采用液氮棉團(tuán)連續(xù)冷凍3 min即可。A組和B組不進(jìn)行治療；C組進(jìn)行髓芯減壓+自體松質(zhì)骨植入治療，在自然復(fù)溫以后從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)進(jìn)行鉆孔，深度約為4 mm，植入自體松質(zhì)骨，關(guān)閉傷口；D組在髓芯減壓基礎(chǔ)上植入膠原基骨修復(fù)材料（天津市賽寧生物工程技有限公司，國械注準(zhǔn)20143461867），關(guān)閉傷口；E組在髓芯減壓基礎(chǔ)上植入吸附有VEGF（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司）的膠原基骨修復(fù)材料（約含500 ng VEGF），關(guān)閉傷口。術(shù)后臀大肌注射硫酸慶大霉素注射液，2 mL/次，1次/d，連續(xù)治療3 d。所有家兔均治療8周。

1.4 血液流變學(xué)測定治療8周后，所有家兔禁食12 h后采集清晨耳緣靜脈血3 mL，迅速置入肝素抗凝管。采用LBY?N6B型全自動血液流變儀測定全血黏度（高切 150 s?1和低切 10 s?1）、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積。

1.5 血脂測定收集3 mL耳緣靜脈血，不加抗凝劑，待血清析出后，采用日立7170A自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）。

1.6 組織病理學(xué)染色取股骨頭用0.9%氯化鈉沖洗，脫鈣，切成5 mm厚的石蠟切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色（碧云天生物技術(shù)研究所），顯微鏡下觀察切片。

1.7 qRT?PCR治療8周后，處死家兔并取出股骨頭，用預(yù)冷的DEPC水沖洗，用組織研磨機(jī)將股骨頭在液氮中粉碎，用Trizol試劑（美國Thermo Fisher）提取股骨頭勻漿總RNA。用氯仿分層總RNA，然后用異丙醇沉淀。沉淀的總RNA用75%乙醇洗滌，并在RNase?free水（美國Thermo Fisher）中溶解。使用SuperScripⅣ逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Thermo Fisher）合成相應(yīng)的cDNA，然后在伯樂CFX Con?nect熒光定量PCR儀下用PowerUp SYBR Green Master Mix（美國Thermo Fisher）進(jìn)行擴(kuò)增。所用的引物如表1所示，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。以GAP?DH 作為內(nèi)參基因，用 2?ΔΔCt法計(jì)算 mRNA 相對表達(dá)量。von Hippel?Lindau（VHL）、缺氧誘導(dǎo)因子α（HIF?1α）、VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bF?GF）和GAPDH引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔的一般情況觀察本研究過程中無家兔死亡。A組家兔精神萎靡不振，行動遲緩，皮毛無光澤，皮下脂肪減少，彈跳能力降低。B、C和D組家兔精神狀態(tài)和活動靈敏度均優(yōu)于A組，皮毛呈現(xiàn)光澤，其中D組家兔的一般情況優(yōu)于其他組。

2.2 各組家兔的血液流變學(xué)水平與A組比較，B組的全血黏度（高切 150 s?1和低切 10 s?1）、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積均顯著升高（P＜0.05）。與B組比較，C、D和E組的全血黏度（高切150 s?1和低切10 s?1）、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積均顯著降低（P＜0.05）。與C和D組比較，E組的全血黏度（高切150 s?1和低切 10 s?1）、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積均顯著降低（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 各組家兔的血液流變學(xué)水平Tab.2 Hemorheology levels of rabbits in each group±s

表2 各組家兔的血液流變學(xué)水平Tab.2 Hemorheology levels of rabbits in each group±s

分組A組B組C組D組E組F值P值全血黏度（高切，mPa·s）2.26±0.10 3.37±0.09 2.86±0.13 2.66±0.11 2.55±0.10 92.584＜0.001全血黏度（低切，mPa·s）4.35±0.45 6.62±0.27 5.65±0.58 5.16±0.37 4.79±0.16 29.882＜0.001血漿黏度1.21±0.05 1.59±0.10 1.54±0.10 1.41±0.08 1.36±0.09 18.965＜0.001紅細(xì)胞壓積（%）34.31±0.65 46.80±0.93 42.34±1.02 40.70±0.32 37.12±1.14 186.561＜0.001

圖2 各組家兔的血液流變學(xué)指標(biāo)分布情況Fig.2 Distribution of hemorheology indexes of rabbits in each group

2.3 各組家兔的血脂指標(biāo)水平與A組比較，B組的血清TC和TG均顯著升高（P＜0.05）。與B組比較，C、D和E組的血清TC和TG均顯著降低（P＜0.05）。與C和D組比較，E組的血清TC和TG均顯著降低（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組家兔的血清TC和TG水平Tab.3 Serum TC and TG levels of each group of rabbits x±s，mmol/L

圖3 各組家兔的血清TC和TG水平分布情況Fig.3 Distribution of serum TC and TG levels of rabbits in each group

2.4 各組家兔的股骨頭組織病理學(xué)變化治療8周后，與B組相比，C、D和E組骨髓結(jié)構(gòu)紊亂程度均減輕，骨小梁形成增多，且骨小梁錯(cuò)亂情況減輕，骨髓中微血管形成明顯增多，且壞死區(qū)基本被修復(fù)。此外，E組股骨頭組織明顯優(yōu)于其他組。見圖4。

圖4 股骨頭組織HE染色（×400）Fig.4 HE staining of femoral head tissue（× 400）

2.5 各組家兔的股骨頭組織中VHL、HIF?1α、VEGF和bFGF的轉(zhuǎn)錄與A組比較，B組股骨頭組織中VHL、HIF?1α、VEGF和bFGF mRNA水平均顯著升高（P＜0.05）。與B組比較，C、D和E組股骨頭組織中VHL mRNA水平顯著降低，而HIF?1α、VEGF和bFGF均顯著升高（P＜0.05）。與C和D組比較，E組股骨頭組織中VHL mRNA水平顯著降低，而HIF?1α、VEGF和bFGF均顯著升高（P＜ 0.05）。見表4和圖5。

表4 各組家兔的股骨頭組織中VHL、HIF?1α、VEGF和bFGF的mRNA相對表達(dá)量Tab.4 Relative mRNA expressions of VHL，HIF?1α，VEGF and bFGF in femoral head tissue of rabbits in each group x±s

圖5 各組家兔的股骨頭組織中VHL、HIF?1α、VEGF和bFGF的mRNA分布情況Fig.5 mRNA distribution of VHL，HIF?1α，VEGF and bFGF in femoral head tissue of rabbits in each group

3 討論

微循環(huán)是微動脈與微靜脈之間毛細(xì)血管中的血液循環(huán)，大量研究顯示，ONFH過程中出現(xiàn)微循環(huán)障礙[14]。血漿黏度是血液流變學(xué)特性，血漿黏度直接決定血液流速及血栓形成。全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積升高可導(dǎo)致微循環(huán)障礙，并造成局部組織缺血缺氧，這也是ONFH形成的主要病理過程。本研究顯示，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF顯著降低了ONFH家兔的全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積，從而減輕了微循環(huán)障礙。微循環(huán)障礙不僅與血管生成有關(guān)，而且與脂質(zhì)代謝有關(guān)。脂質(zhì)代謝紊亂可導(dǎo)致脂肪栓塞和骨細(xì)胞脂肪變性，引起微循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致ONFH。本研究顯示，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF顯著降低了ONFH家兔的血清TC和TG，從而改善了脂質(zhì)代謝。功能正常的血管系統(tǒng)在骨骼再生過程中至關(guān)重要，血管系統(tǒng)障礙可引起骨組織發(fā)生壞死并抑制骨形成，因此，血管生成在加速骨折愈合中起重要作用[15]。VEGF已被證明是成骨和血管生成過程的重要組成部分，其可刺激骨損傷部位血管再生[16-18]，并且，VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、調(diào)節(jié)成骨生長因子刺激成骨等多種功能[19]。低氧可能啟動細(xì)胞內(nèi)的代償反應(yīng)和低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，這種反應(yīng)依賴于HIF?1α[20]。HIF?1α 是一種普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，HIF?1α積累、轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并調(diào)節(jié)其靶基因（包括VEGF）的轉(zhuǎn)錄[21]。報(bào)告顯示，缺乏HIF?1α的小鼠的小梁骨體積減小，HIF?1α通路的激活是骨形成和血管生成的關(guān)鍵機(jī)制，HIF?1α?xí)谌毖鯒l件下增加成骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)[22]。此外，HIF?1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，從而增強(qiáng)了血管生成和成骨并防止骨丟失[23]。VHL在HIF?1α/VEGF信號的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，VHL已被證明可抑制HIF?1α 的表達(dá)[24]。在常氧條件下，HIF?1α與 VHL結(jié)合，并通過泛素化降解VHL[25]。以前的研究表明，VHL的丟失與骨細(xì)胞中HIF?1α信號的激活相一致，在骨發(fā)育、動態(tài)平衡和再生中發(fā)揮著重要作用[26]。VHL 的丟失通過增強(qiáng) HIF?1α 的表達(dá)顯著促進(jìn)血管生成[27]。本研究顯示，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF顯著降低了ONFH家兔股骨頭組織中VHL的mRNA水平，而升高了HIF?1α和VEGF mRNA水平（P＜0.05）。這些結(jié)果說明，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF可能通過VHL/HIF?1α/VEGF信號來調(diào)節(jié)血管生成。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF顯著增加了ONFH家兔股骨頭組織中bFGF的mRNA水平，從而促進(jìn)了血管生成和骨形成（P＜0.05）。bFGF在血管及成骨方面具有重要作用，其不僅可以通過誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖來促進(jìn)血管生成，而且可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，加速骨形成。

本研究結(jié)果顯示，髓芯減壓、膠原基骨修復(fù)材料和VEGF均有效促進(jìn)了骨小梁形成和血管生成，促進(jìn)了ONFH區(qū)域的修復(fù)。此外，髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF治療效果顯著優(yōu)于髓芯減壓+自體松質(zhì)骨組和髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料組。分析其原因，主要包括以下方面：（1）髓芯減壓通過降低骨內(nèi)壓、改善血供、刺激血供豐富的大轉(zhuǎn)子部的血管沿減壓隧道長入股骨頭內(nèi)，從而促進(jìn)壞死股骨頭的修復(fù)[5]。（2）膠原基骨修復(fù)材料中的膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，可為細(xì)胞生長、增殖提供適宜的環(huán)境。另外，膠原基骨修復(fù)材料具有貫通性良好的孔隙率和多尺度孔徑，可充分保證血液在其中的流動以及細(xì)胞的遷徙與附著，并且能夠提高自體誘導(dǎo)的效果和材料在骨重建中的再利用。（3）VEGF能特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和血管生成，血管長入骨痂可促進(jìn)形成新骨，對骨痂進(jìn)行改造塑形[7]。此外，VEGF能直接刺激成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移與分化。因此，這三種手段的聯(lián)合治療充分發(fā)揮了各材料的優(yōu)勢，從而最大限度地促進(jìn)了ONFH區(qū)域的修復(fù)。

綜上所述，本研究表明髓芯減壓+膠原基骨修復(fù)材料+VEGF可有效促進(jìn)ONFH家兔損傷區(qū)域的成骨和血管修復(fù)，并且可減輕微循環(huán)障礙，其機(jī)制與改善脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)VHL/HIF?1α/VEGF信號及bFGF表達(dá)有關(guān)。該治療方法可能是治療ONFH的新型高效療法，具有較高的臨床研究價(jià)值。