水稻種子內生細菌研究進展

王志山 黎妮 王偉平 劉洋

（1. 北京科技大學化學與生物工程學院，北京100083；2. 湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，長沙410125）

植物內生菌（endophyte）是一類一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部而不引起侵染癥狀的重要微生物資源，在長期的相互作用過程中，植物與內生菌已經形成了互惠互利的關系，成為植物進化過程的重要組成部分［1-3］。植物內生菌的發(fā)現最早可以追溯到100多年前，但是由于其本身特性，即寄主植物未表現出類似于病原菌感染的癥狀，所以一直被人們忽視；直到20世紀30年代，許多牲畜由于食用感染內生真菌的牧草導致中毒，給畜牧業(yè)造成重大損失，為此植物內生菌的研究也才真正引起人們的重視。已有研究表明，植物中存在大量內生菌，它們在宿主植物的內部組織中定居并形成一系列互利、共生、共棲的關系［4］。植物內生菌除了具有促進幼苗萌發(fā)、促進植物生長、提高產量、增強抗性、誘導次生代謝產物合成等生物功能外，其天然產物在醫(yī)藥業(yè)、農業(yè)、工業(yè)等領域都具有潛在用途［5-8］。

種子既是植物的繁殖器官、植物遺傳信息的保存者和傳遞者，也是植物在逆境脅迫中保證物種繁衍的適應性策略，對植物繁殖后代及農業(yè)生產具有重要意義［9-10］。大量研究證明，植物種子中含有豐富的內生菌資源，在植物繁衍過程中，種子是細菌從母本植株到子代個體的傳播介質，負責將有益細菌代代相傳，從而對植物的生長發(fā)育及品質產量等生物性狀產生直接或間接的影響［3，11-13］。水稻作為禾本科作物，是植物與內生菌相互作用的理想模式植物，研究水稻種子與其內生菌之間的作用關系及機理，對水稻增產、病蟲害防治有積極意義。本文結合近年來本項目組的研究進展及相關領域動態(tài)，從水稻種子內生菌多樣性、種子與內生菌分布的相關性、內生菌生物學功能以及垂直傳遞規(guī)律等4個方面，系統(tǒng)總結近年來水稻種子內生菌研究領域所取得的進展，旨在為后續(xù)水稻種子內生菌的相關研究提供思路和方向。

1 水稻種子內生菌多樣性研究

隨著分子生物學技術發(fā)展和檢測手段的不斷提高，水稻內生菌檢測的靈敏度越來越高，水稻內生菌的多樣性研究已成為水稻內生菌研究領域的重要內容。水稻內生菌除了包括與水稻構成互惠共利關系的內生真菌、細菌和放線菌外，還包括潛伏在水稻體內的病原微生物。研究水稻內生菌的多樣性對于探究水稻體內的細菌群結構組成及其變化規(guī)律等有重要意義，同時也能為相關功能菌株的篩選和應用提供理論依據。

1.1 利用分離培養(yǎng)方法（isolation and culture methods）揭示水稻種子內生細菌多樣性

分離培養(yǎng)技術是一種傳統(tǒng)的植物內生菌多樣性研究技術，其常被研究人員用來探究水稻種子內生細菌的多樣性。例如，李南南等［14］采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對3個品種的雜交水稻種子內生細菌群落結構多樣性進行了分析，結果表明這些雜交水稻種子內生細菌群落結構具有多樣性，其中在門水平主 要 以 Firmicutes、Proteobacteria和 Actinobacteria類群為主，但在屬水平上三者存在優(yōu)勢屬及豐度差異。另有報道采用分離培養(yǎng)技術探究寄主基因型和鹽脅迫對鹽敏感和耐鹽水稻品種種子內生細菌群落的影響，試驗結果表明水稻種子內部的內生細菌群落具有相當豐富的多樣性，而且在鹽脅迫條件下，鹽敏感和耐鹽水稻品種的內生細菌群落向黃桿菌屬（Flavobacterium）、泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、小坂菌屬（Kosakonia）和短小桿菌屬（Curtobacterium）的細菌類群轉移［15］。此外，也有報道采用分離培養(yǎng)技術揭示出水稻種子中存在種類繁多的內生細菌［16-20］。

1.2 利用非培養(yǎng)方法（culture-independent methods）揭示水稻種子內生細菌多樣性

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術具有一定的局限性，只能鑒定出寄主植物內一些可培養(yǎng)的內生菌，且分離出的大多數是較活躍的少量內生菌類群。對于植物體內無法培養(yǎng)的內生菌，則需要采用非培養(yǎng)技術加以鑒定，而且有必要使用多相方法對可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的兩類內生菌進行全面的分析研究。目前，用于植物內生菌多樣性分析的非培養(yǎng)技術主要包括16S rDNA克隆文庫技術、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術和高通量測序技術（high-throughput sequencing）等［3，21-25］。

16S rDNA克隆文庫技術與DGGE技術出現的比較早，有研究人員利用這兩種技術探究了水稻種子內生細菌的多樣性［21，26］。但是隨著測序技術的發(fā)展，近年來越來越多的研究人員開始使用高通量測序方法探究水稻種子內生細菌的多樣性。Zhang等［25］采用基于Illumina的16S rRNA基因對水稻種子內生細菌群落進行研究時發(fā)現，水稻種子內存在種類豐富的內生細菌，而且首次在水稻種子中檢測到一些細菌菌群，如酸桿菌門（Acidobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、衣原體（Chlamydiae）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。本課題組之前也利用同樣方法探究了超級雜交稻與旱稻種子的內生細菌多樣性發(fā)現，不同品種種子間也存在類型豐富的內生細菌，且很多細菌類型與之前的報道結果一致［3，27］。由此可見，在未來的水稻內生菌的研究中，通過結合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)分析方法，可以為研究水稻內生菌提供強有力的技術支撐，有助于鑒定并獲得一些新的難以分離篩選的功能性內生菌株。

2 水稻種子與其內生細菌分布的相關性研究

2.1 種子內部結構與內生細菌的相關性

已有報道指出，植物種子內部的不同結構中內生細菌分布有差異［28-31］。對于水稻種子而言，Eyre等［32］利用高通量測序技術鑒定水稻種子微生物群落，結果同樣證實水稻種子由內到外不同結構部位內生細菌分布不同?？傮w而言，水稻種子內生細菌的擴增子序列變異體（amplicon sequencing variants，ASV）由外至內呈下降趨勢，但種子內部的細菌多樣性比外殼和種皮的細菌多樣性高，表明水稻種子內部雖然存在的細菌類群數量不多，但其豐度相比于種子外部更均勻。此外，研究人員還發(fā)現水稻種子外殼及種皮等隔室中α-變形菌（α-Proteobacteria）的豐度遠高于種子內部，而種子內部γ-變形菌（γ-Proteobacteria）的豐度高于種子外殼及種皮部分［32］。由此可見，水稻種子內生細菌類群分布與其內部結構密切相關。

2.2 種子發(fā)育時期與內生細菌的相關性

種子從形成、成熟到最終發(fā)芽，不同發(fā)育時期內生細菌類群是呈動態(tài)變化的，其種類和組成會發(fā)生改變，某些種類細菌也會發(fā)生運動和轉移，尤其是隨著種子的發(fā)育，淀粉等營養(yǎng)物質的積累和變化會影響到其固有微生物種類的組成［33］。對于雜交水稻親本深08S、620S和16A007種子灌漿期及成熟期兩個不同發(fā)育時期內生細菌多樣性的研究表明，3個品種水稻種子不同發(fā)育時期的內生細菌群落結構變化明顯，種子成熟期內生細菌種類較灌漿期更高，而且優(yōu)勢細菌種類也存在差異［34］。另有研究指出，當種子吸脹后，其初級和次級代謝物會迅速釋放到鄰近的土壤，從而形成一個“萌發(fā)種子周圍微生物活性升高”的區(qū)域，即種子際（spermosphere），由于種子際高度集中微生物生長所需營養(yǎng)物質，所以種子上或種子內的細菌相比于周圍土壤環(huán)境中的微生物類群具有更大的競爭優(yōu)勢，表明種子際相關微生物類群組成可能受土壤環(huán)境影響更大［35］，同時種子吸脹萌發(fā)時間對于種子際微生物菌落在門、屬水平上的類型和豐度都有一定影響［36］。從研究文獻檢索情況來看，目前對于水稻種子發(fā)育時期與其內生細菌演替的研究仍然有限。

2.3 種子化學成分與內生細菌的相關性

水稻種子內部常見的化學成分大多是一些營養(yǎng)物質，如淀粉、儲藏蛋白和脂類等，它們以不同的比例儲藏在種子各組織中［37］。這些營養(yǎng)物質不僅是水稻種子發(fā)育生長所需，同時也是種子內生細菌賴以生存的物質條件，故水稻種子的化學成分與其內生細菌可能存在一定相關性。根據已有報道，隨著水稻種子的成熟，內部淀粉等營養(yǎng)物質含量會逐漸上升，水分含量也會相應發(fā)生變化，這一系列化學組分的變化會直接或間接地影響種子內生菌的群落結構組成，具有產生分解淀粉等營養(yǎng)物質的相關酶、耐高滲透壓及抗菌活性的內生菌會明顯增多［38-40］。另一方面，有研究人員對分離自水稻種子內部的有益內生細菌進行功能探究，結果發(fā)現這些內生菌對于植物的生長、生化組分及營養(yǎng)物質積累也有很強的促進作用［19，41-42］。然而，根據以上研究報道也只能初步判斷水稻種子化學成分與其內生細菌之間具有潛在的相關性，至于種子化學成分分布對于其內生細菌分布是否直接產生影響還需要研究人員進行更深層次的探究。

2.4 種子活力與內生細菌的相關性

種子活力是衡量種子質量的重要指標之一，決定著植物能否迅速、均勻地出苗并且能夠發(fā)育為正常植株。一般活力較高的種子其雜交的后代往往具備較高活力，而植物種子如果保存條件良好，其活力也可以保持幾年甚至幾十年，所以說，植物種子活力的影響因素一般包括遺傳因素與環(huán)境因素兩方面［33，43-44］。最新研究發(fā)現，植物種子的活力高低對其內生菌群落多樣和密度也有很大的影響。研究人員觀察到，潮濕氣候下植物種子由于具有較干燥環(huán)境下更適宜的生長條件，其活力往往更高，所以長出植株的均勻度好、抗病能力也就更強，而針對其內生菌進行研究發(fā)現，高濕環(huán)境下生長的植物種子其內生細菌的群落更密集，多樣性也更高［45］。除此之外，如果從遺傳學角度去考慮，雖然大多研究都表明種子活力與其基因型有直接聯(lián)系，但種子母本植株垂直傳播的相關內生細菌對于種子活力也是一個重要影響因素［46-48］。目前，水稻種子活力高低與其內生細菌的相關性研究還比較少。之前有研究人員將分離自雜交水稻種子的細菌接種到6份雜交稻樣品中，以驗證其是否對水稻種子結實率及生活力產生影響，結果表明噴施該細菌對延長水稻種子活力有明顯效果，其中噴施細菌液后當代水稻種子帶細菌率相比對照組增加5.4%-37.8%，儲藏兩年后帶細菌率相比對照組增加0.7%-9.7%，發(fā)芽率增加16.1%-26.1%［49］。

2.5 種子基因型與內生細菌的相關性

水稻種子作為攜帶親本基因的雛形植物體（microphyte），具有一致性和遺傳性特征，因此，水稻的基因型與種子的內生細菌之間可能具有某種相關性，越來越多的研究報道也證實了這一觀點。研究人員在分析水稻種子內生細菌群落結構及多樣性時發(fā)現，水稻種子基因型對種子內生細菌群落多樣性、結構、分布、豐度有一定影響［3，11，15，20，25］，不同基因型的種子之間雖然存在共存的內生優(yōu)勢細菌類群，但它們在內生細菌群落結構與多樣性方面存在差異［3，50］。有些研究發(fā)現不同品種種子間的內生細菌群落結構與多樣性較相似，但在細菌類群的豐度上其間仍存在一定差異［27］。值得一提的是，部分研究表明，水稻親本與其雜交子代的種子內生細菌群落結構與多樣性也具有明顯的相關性，而且它們的內生優(yōu)勢細菌尤為相似［3，11］?？偠灾鲜鲅芯繛樗痉N子基因型與內生細菌的分布具有相關性提供了有力的論據。

2.6 水稻抗病性與種子內生細菌的相關性

稻瘟病、紋枯病、惡苗病等都是水稻生長發(fā)育過程中最常見的病害，這些病害的大面積發(fā)生會嚴重影響水稻產量［51］。最新研究發(fā)現，水稻種子內生細菌作為宿主植物的“延伸免疫系統(tǒng)”，對于水稻拮抗病原菌有著重大作用。研究指出，水稻抗病性分化不僅具有地理分布差異性，而且與其種子內生細菌群落結構的差異緊密相關，其中具有抗性表型的水稻種子鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的富集顯著，并且其核心成員——瓜類鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas melonis）除能在具有抗性表型的種子中世代傳遞外，亦可賦予易感表型抗病性［52］。在進行深入的機制探究后發(fā)現，瓜類鞘氨醇單胞菌在水稻感染細菌性穗枯病菌（Burkholderia plantarii）時會作出負反饋響應并在在質外體中積累化學小分子信號氨茴酸，當B. plantarii接觸氨茴酸后，其RpoS轉錄級聯(lián)反應調控的毒力因子（tropolone）生物合成通路就會受到干擾，導致侵染力的喪失［52］。除此之外，也有部分研究從水稻種子中分離出具有拮抗水稻相應病原菌活性的內生細菌菌株［7，53-55］，而且進一步實驗表明，具拮抗活性的細菌菌液處理的水稻種子病害發(fā)生率會大幅度降低，萌發(fā)幼苗的莖長與根長比對照長［7］。綜上所述，水稻本身的抗病性高低對于其種子中的內生細菌會有一定的篩選作用，且水稻種子中這些抗病性較強的內生細菌對于水稻的生長和抗病蟲害能力都有一定的促進與增強作用，說明研究人員能在一些抗病性較強的水稻種子中篩選并鑒定出一些具有抗病性的內生細菌并不是偶然的。

3 水稻種子內生細菌的生物學功能研究

3.1 直接促生長作用

種子內生細菌一般通過分泌和誘導產生植物生長調節(jié)物質、溶解土壤中的磷元素及合成并分泌鐵載體等機理，對植物生長發(fā)育產生直接影響［41，56-62］。研究發(fā)現，水稻種子內生細菌對水稻的直接促生長作用也是通過類似的機制實現。Shahzad等［56］對水稻種子所攜帶的內生細菌進行分離鑒定并評估了它們在植物激素生產和促進生長方面的潛力，實驗結果表明，水稻種子中產生吲哚-3-乙酸（IAA）的內生細菌顯著提高了植株的大部分生長特性（莖和根長、鮮生物量和干生物量及葉綠素含量等）。此外，研究人員通過對水稻種子內生細菌的促生特性研究發(fā)現，水稻中通過種子傳播的內生細菌可以通過調節(jié)植物激素及某些代謝產物、固氮、分泌鐵載體和溶解磷酸鹽等多重作用促進水稻植株的生長［41，63］。

3.2 間接促生長作用

種子內生細菌除了可以通過合成并分泌植物生長激素、鐵載體等來直接對植物生長產生促進作用外，種子內生細菌也可以通過提高植物對環(huán)境脅迫的抗性、產生生物固氮作用或提高對植物病原微生物的拮抗作用等來間接促進植物生長［57-58，64-69］。研究表明，包括水稻在內的大部分植物內生固氮菌一般通過定殖在植物內部并利用植物本身碳源，與植物進行聯(lián)合固氮，促進植物生長，同時植物體內相對低氧的狀態(tài)也有利于細菌固氮酶的表達與作用［70-71］。研究人員也已經在水稻種子中分離出具有固氮作用的內生細菌［41，63］。與此同時，水稻種子中具有拮抗病原微生物的內生細菌也是水稻內生菌研究領域的一大熱點。截至目前，研究人員已經從水稻種子中分離得到了一批具有良好抑病效果的植物內生細菌［7，52-55］。水稻種子內生細菌拮抗病原微生物的機制主要包括分泌抗生素等抗菌物質、競爭生態(tài)位與營養(yǎng)物質、誘導系統(tǒng)抗性、作為外源基因載體等幾方面［52，72-73］。本課題組利用高通量測序技術對水稻種子內生細菌進行分析時發(fā)現旱稻種子中除含有水稻種子中常見的一些內生細菌外，也有抗旱性較強的細菌屬［27］；對于耐鹽堿水稻種子內生細菌進行研究時同樣分離鑒定出多株具有耐鹽活性的細菌（數據尚未發(fā)表）。由此可見，水稻種子內生細菌對于宿主的抗逆性增強也可能發(fā)揮著重要作用，但是目前這方面的研究還相對較少，相關的機制研究也有待進一步探究。

4 水稻種子內生細菌的垂直傳遞研究

植物體可以通過世代間及其個體生命周期中獲得其內生微生物群落的能力來應對其生存環(huán)境的改變［74］。植物中的微生物能夠通過水平轉移和垂直傳遞的方式從環(huán)境和母體植物中獲得，而在通過垂直傳播所形成的植物體中，這種關系是專性的，這些微生物整個生命周期全部在宿主植物體內度過，往往無法在環(huán)境中獨立生存［75］，并且當這種互惠互利的關系穩(wěn)定建立之后，就會在該植物的世代之間進化出內生微生物的垂直傳播途徑，以確保這種有益的互利關系從一代忠實地傳遞到下一代，并在種子萌發(fā)及植物成長過程中發(fā)揮重要生物學作用［67，76］。種子是內生菌在宿主植物世代之間垂直傳遞的主要途徑，并充當植物微生物組的儲存庫［35，77-80］。支持植物內生菌通過種子垂直傳遞的現有證據來自證實種子與幼苗之間內生菌類群重疊關系的研究［74，81］，且研究發(fā)現與種子外部菌群相比，種子內的微生物更具有迅速定殖于新生植物并占據植物體內空間的優(yōu)勢，且更易于利用植物所提供的營養(yǎng)成分［82］。截至目前，已有研究報道表明多種植物存在可以在宿主植物世代之間連續(xù)垂直傳遞的特定菌群［3，29，74，83-87］。目前，水稻種子內生細菌的垂直傳遞研究也已經取得了一定成果。Walitang等［11］研究了水稻種子經過雜交、重復近交、人類選擇和在不同生態(tài)地理位置種植后其內生菌組成隨時間的變化，結果發(fā)現雙親或雙親之一在后代種子內生菌的形成過程中做出了重大貢獻，后代的大多數末端限制性片段（T-RFs）可以追溯到其任何一個親本或雙親，即使在不同的地理位置重新種植，許多類似的內生細菌群體仍然存在于種子中。本課題組以我國自主培育的超級雜交稻新品種深兩優(yōu)5814及其親本Y58S和C4114種子作為材料，研究了它們的內生細菌結構和多樣性，實驗結果表明3個樣品雖然在內生細菌群落組成和結構上存在明顯差異，但子代種子的優(yōu)勢內生細菌屬與其親本保持一致，均為Pantoea［3］。由此可見，水稻親本對于其后代種子內生菌的形成過程有重要作用，而且種子中存在特定菌群在水稻世代之間存在垂直傳遞的連續(xù)性，母源傳播很可能是水稻種子微生物群落傳播的主要途徑［3，11，88］。

5 雜交水稻（hybrid rice）種子內生細菌研究現狀及展望

5.1 雜交水稻種子內生細菌研究現狀

雜交水稻一般是指兩個在遺傳上有一定差異但其優(yōu)良性狀能互補的水稻親本進行雜交所產生的具有雜種優(yōu)勢的水稻品種，其普遍具有高產、優(yōu)質、廣適及多抗等特點［89］。針對雜交水稻種子內生細菌的多樣性與群落結構進行的相關研究結果表明，雜交水稻種子中不僅存在種類豐富的內生細菌屬，而且其中的優(yōu)勢屬與常規(guī)水稻品種種子中的優(yōu)勢細菌 屬 類 似，Pantoea、Bacillus、Methylobacterium、Pseudomonas、Sphingomonas及Rhizobium 等 細菌同樣存在于雜交水稻種子中［3，14，16-17，90-92］。Liu 等［93］也從雜交水稻種子中分離到一株新的細菌，并將其命名為湖南擬芽孢桿菌（Paenibacillus hunanensis sp. nov.）。深兩優(yōu)5814是一個在生產上大面積應用的雜交水稻品種，有研究人員通過拮抗實驗從其種子中分離到一株內生細菌菌株Paenibacillus polymyxa RSE1，研究結果表明這株菌對于稻曲病菌（Ustilaginoidea oryzae）CICC具有較強的拮抗活性［54］。本課題組通過平板對峙實驗也從雜交水稻深兩優(yōu)5814種子中分離出一株對稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）ACCC 36020有明顯拮抗活性的菌株 JK，經鑒定這株菌為 Bacillus velezensis［55］?？傮w而言，目前對于雜交水稻種子內生細菌的研究相對較少，尤其是不同類型的雜交水稻種子與其內生細菌的相關性研究鮮有報道。

5.2 雜交水稻種子內生細菌未來研究方向

對雜交水稻種子內生細菌開展系統(tǒng)研究，對于從微生態(tài)學角度揭示雜交水稻高產、優(yōu)質、多抗機制具有重要作用。開展不同類型雜交水稻品種種子內生細菌的遺傳多樣性、親本與子一代的垂直傳遞規(guī)律、種子內生細菌對雜交水稻產量、品質、抗性（抗病蟲、耐逆等）的形成機制等研究，解決雜交稻種子益生菌定殖關鍵技術，利用現代生物技術研發(fā)人工益生細菌，研發(fā)一批有益促生菌劑應用于雜交水稻生產，促進雜交水稻高產、優(yōu)質、多抗，推動雜交水稻高產高效綠色生產發(fā)展，為保障國家糧食安全提供科技支撐，這是雜交水稻種子內生細菌未來的重點研究方向。

6 結語

對于植物內生菌與育種的關系，一種新的育種策略“植物與微生物共生體育種（plant holobiont breeding）”思路也被提出［94］。該育種思路的立論基于兩點：一是某些植物的培育實際上是植物/微生物共生體的培育；二是植物內生菌與宿主植物之間或多或少存在相互作用，不同基因型的宿主植物對內生菌的種類和分布等均可能有所選擇。因此，可以設想通過改變宿主植物的遺傳背景，改變宿主植物從環(huán)境中接納的植物內生菌種類，從而達到改變植物（實際上是植物內生菌/宿主共同體）表型的目的?；谶@種育種設想，今后在水稻育種中可能也需要考慮微生物因素，重視微生物在水稻新品種表型及其他性狀形成中的影響，加強微生物對水稻育種事業(yè)的貢獻值，這不僅對豐富作物育種科學內涵，還是對生產應用而言，都是一件有意義的工作。因此，雜交水稻種子內生細菌的研究今后主要還是圍繞雜交水稻高產、優(yōu)質、多抗等特性開展，重點開展雜交水稻種子內生促生菌與內生拮抗菌資源鑒定篩選，并通過雜交水稻與微生物相互作用的研究闡明其機制機理，達到從植物中來到植物中去的內生菌挖掘與利用目標，最終實現共生體育種目標。同時，結合水稻種子內生菌垂直傳遞、子代對于親本優(yōu)勢細菌繼承等研究，為水稻雜種優(yōu)勢利用提供微生物生態(tài)學佐證，也值得深入研究和探索。