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    新型冠狀病毒核酸快速檢測單靶標(biāo)陽性結(jié)果分析

    2022-02-02 08:18:12李育敏龔海娜付曉歌曾子郎郭東月姚潔儀李雙張秀明
    臨床檢驗(yàn)雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)核酸試劑

    李育敏,龔海娜,付曉歌,曾子郎,郭東月,姚潔儀,李雙,張秀明

    (深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室&深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東深圳 518001)

    2021年8月,《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識(shí)》發(fā)布[1],提出新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)核酸快速檢測是常規(guī)檢測的補(bǔ)充,在因特定原因需盡快獲得檢測結(jié)果、待檢人群數(shù)量較少、實(shí)驗(yàn)室空間場地限制的情況下,可考慮采用快速檢測。為貫徹落實(shí)國家對發(fā)熱門診、機(jī)場、海關(guān)、口岸、火車站等場景需要快速出具核酸檢測報(bào)告的疫情防控策略,新型冠狀病毒核酸快檢迅速在上述各機(jī)構(gòu)開展起來。核酸快檢技術(shù)雖然明顯縮短了檢測時(shí)間,使陽性感染者能夠得到快速有效的管控,降低其繼續(xù)傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn),但是同樣也面臨著檢測靈敏度和特異性的問題,尤其是單靶標(biāo)陽性結(jié)果,需要再次進(jìn)行復(fù)核[1],增加了檢出的時(shí)間。因此,實(shí)驗(yàn)室為確保核酸快檢結(jié)果及時(shí)、準(zhǔn)確,需做好質(zhì)量控制(質(zhì)控)和結(jié)果判讀。本研究對收集到的核酸快檢單靶標(biāo)陽性結(jié)果進(jìn)行分析探討,以期為臨床實(shí)驗(yàn)室檢測和結(jié)果判讀、復(fù)核及解釋提供參考。

    1 材料與方法

    1.1樣本 收集2021年1月1日至2022年8月16日在深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室采用快檢試劑檢測的咽拭子標(biāo)本,所有樣本均為單獨(dú)采樣。嚴(yán)格按照醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)和新型冠狀病毒肺炎防控方案(第九版)要求[2-3]進(jìn)行樣本采集、送檢和保存。

    1.2試劑與儀器 核酸提取試劑盒(磁珠法,重慶中元匯吉公司),新型冠狀病毒2019-nCoV核酸快檢試劑盒(熒光PCR法,達(dá)安基因公司),新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,上海伯杰公司)。EXM6000全自動(dòng)核酸提取儀(重慶中元匯吉公司),AGS8830-8型和AGS8830-16型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(杭州安譽(yù)公司,用于核酸快檢),SLAN-96S熒光定量PCR儀(上海宏石公司,用于核酸常規(guī)檢測)。

    1.3標(biāo)本處理和檢測 將病毒采樣管置于振蕩器上,振蕩10 min,分別采用快檢(達(dá)安試劑)和常規(guī)檢測(伯杰試劑)2種方法進(jìn)行平行檢測。按照核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取,按照核酸擴(kuò)增檢測試劑盒說明書進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

    1.4結(jié)果判讀

    1.4.1室內(nèi)質(zhì)控 3份陰性質(zhì)控檢測結(jié)果均為陰性,1份弱陽性質(zhì)控結(jié)果為陽性,且Ct值符合預(yù)期值,視為室內(nèi)質(zhì)控在控,否則為失控。質(zhì)控在控時(shí)檢測數(shù)據(jù)可接受。

    1.4.2達(dá)安快檢試劑結(jié)果判斷 (1)如果檢測樣本在FAM和VIC通道無擴(kuò)增曲線或Ct值>30,且Cy5通道有擴(kuò)增曲線、Ct值≤30,可判斷樣本為2019-nCoV陰性。(2)如果檢測樣本在FAM和VIC通道Ct值≤30,且有明顯的擴(kuò)增曲線,Cy5通道有或無擴(kuò)增曲線,可判樣品為2019-nCoV快檢結(jié)果陽性。(3)如果出現(xiàn)以下2種情況,結(jié)果須復(fù)檢(同試劑):a.檢測樣本僅在 FAM或VIC單一通道Ct值≤30,另一通道Ct值>30或無擴(kuò)增曲線,Cy5通道有或無擴(kuò)增曲線;b.檢測樣本在FAM通道Ct值>30或無擴(kuò)增曲線,VIC通道Ct值>30或無擴(kuò)增曲線,Cy5通道Ct值>30或無擴(kuò)增曲線。復(fù)檢結(jié)果判定:內(nèi)標(biāo)Ct值>30或無擴(kuò)增曲線樣本需重新取樣檢測。

    1.4.3伯杰試劑結(jié)果判斷 (1)如果檢測樣本在FAM和VIC通道Ct值>40,ROX通道Ct值≤40,可判斷樣本為2019-nCoV陰性。(2)如果檢測樣本在FAM、VIC、ROX通道Ct值≤40,且曲線有明顯的擴(kuò)增曲線,可判樣品為2019-nCoV陽性。(3)如果檢測樣本在FAM或者VIC通道Ct值≤40,另一通道無Ct值或大于40,須復(fù)檢(同試劑),復(fù)檢結(jié)果與原結(jié)果一致,可判讀為2019-nCoV陽性,否則為陰性。如快檢和常規(guī)檢測均為單靶標(biāo)陽性,送深圳市疾控中心(CDC)和深圳市羅湖區(qū)CDC復(fù)核。

    1.4.4CDC復(fù)核 CDC對初篩陽性樣本采用2種常規(guī)檢測試劑(達(dá)安基因公司和上海伯杰公司)進(jìn)行復(fù)核。

    2 結(jié)果

    2.1檢測概況 經(jīng)CDC復(fù)核,實(shí)驗(yàn)室通過核酸快速檢測,共檢出陽性257例,其中單靶標(biāo)陽性38例(表1),CDC復(fù)核結(jié)果為陽性或建議重新采樣,包括12例復(fù)陽;其中單靶標(biāo)N基因陽性有20例,單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性18例,建議重新采樣的6例標(biāo)本中,5例為復(fù)陽標(biāo)本。

    2.2單靶標(biāo)N基因陽性 20例單靶標(biāo)N基因陽性結(jié)果的Ct值為26.48~31.06,其中10例為復(fù)陽;經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測,其中13例結(jié)果為雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)陽性,包括5例復(fù)陽;7例仍為單靶標(biāo)N基因陽性,包括5例復(fù)陽,見表1。

    2.3單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性 18例單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性結(jié)果的Ct值為27.17~30.01,其中2例為復(fù)陽;經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測,其中11例結(jié)果為雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)陽性,5例結(jié)果為單靶標(biāo)N基因陽性(包括2例復(fù)陽),2例仍為單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性,見表1。

    表1 38例新冠病毒核酸快速檢測單靶標(biāo)陽性結(jié)果

    3 討論

    按照《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識(shí)》[1],新冠病毒快檢結(jié)果為陽性,應(yīng)使用另外1~2種更為靈敏且擴(kuò)增不同靶區(qū)域的常規(guī)核酸檢測試劑對原始樣本進(jìn)行復(fù)檢,復(fù)核陽性方可報(bào)告結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室在前期對核酸快檢系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證的研究中發(fā)現(xiàn),在廠家聲明的檢出限500 copies/mL濃度水平重復(fù)測定20次,雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)的檢出率僅為65%,這是由于其中單靶標(biāo)N基因的檢出率為20/20,而單靶標(biāo)ORF1ab基因?yàn)?3/20;快檢和常規(guī)檢測2種方法陽性符合率為82.4%[4],這表明針對弱陽性標(biāo)本,快檢系統(tǒng)檢出率低于常規(guī)檢測。本研究中38例快檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測有24例為雙靶標(biāo)陽性,這也提示常規(guī)試劑的靈敏度較快檢系統(tǒng)更高。因此,建議對有中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的城市來源的人群,如口岸入境人員等,可同時(shí)進(jìn)行快檢和常規(guī)PCR 2種方法擴(kuò)增,一方面確保檢測結(jié)果及時(shí),對陽性人員采取“早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早隔離”的措施;另一方面可避免弱陽性標(biāo)本的漏檢,確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

    目前國內(nèi)大部分核酸檢測方法主要針對N基因和ORF1ab基因設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針。在新冠病毒基因組中,N基因相對保守,而ORF1ab基因特異性強(qiáng),是病毒鑒定的重要標(biāo)志物[5]。本研究檢出的38例經(jīng)CDC復(fù)核后的快檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本中,單靶標(biāo)N基因陽性20例,經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測,13例為雙陽,7例仍為N基因單陽;單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性有18例,常規(guī)試劑平行檢出11例為雙陽,5例為N基因單陽(包括2例復(fù)陽),2例仍為ORF1ab單陽。20例快檢N基因單陽中有10例為復(fù)陽;18例快檢ORF1ab基因單陽中,僅2例為復(fù)陽,這提示臨床應(yīng)高度重視快檢單靶標(biāo)ORF1ab基因初篩陽性的結(jié)果。在核酸檢測過程中,由于受ORF1ab基因的拷貝數(shù)和特異性,以及試劑對ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度差異影響,通常觀察到的現(xiàn)象是單靶標(biāo)N基因的陽性率高于單靶標(biāo)ORF1ab基因[6-9],而且還需注意單靶標(biāo)N基因陽性是否為非特異的假陽性,當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)單靶標(biāo)陽性的時(shí)候應(yīng)考慮是否發(fā)生污染。本研究提示發(fā)現(xiàn)快檢單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性時(shí),排除非特異因素,應(yīng)高度警惕其檢測結(jié)果為真陽性的可能,需及時(shí)進(jìn)行常規(guī)試劑復(fù)核,以便盡早報(bào)告結(jié)果。

    本研究有12例快檢單靶標(biāo)陽性為復(fù)陽,其中有快檢結(jié)果為一種單靶標(biāo)陽性,而常規(guī)檢測為另一種單靶標(biāo)陽性的情況,也有快檢呈單靶標(biāo)陽性而常規(guī)試劑檢測為雙靶標(biāo)陽性,這與復(fù)陽個(gè)體體內(nèi)存在的不是活病毒,病毒序列不完整,為殘存的核酸片段有關(guān)。復(fù)陽檢測結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)不同的試劑檢出不同的單靶標(biāo)陽性;或同一種試劑重復(fù)測定檢出不同的單靶標(biāo)陽性;或重復(fù)測定部分陽性,部分陰性;以及檢出陽性后,重新采樣檢測為陰性,連續(xù)多日陰性后又檢出陽性等情況。

    綜上所述,在臨床檢測過程中,應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)史、不同試劑的檢測結(jié)果、原始擴(kuò)增曲線以及Ct值進(jìn)行綜合判斷和結(jié)果分析;對需要重新采樣的樣本應(yīng)嚴(yán)格按照國家文件進(jìn)行重新采樣復(fù)核[3];對復(fù)陽人群參照國家最新發(fā)布的第九版《新型冠狀病毒肺炎防控方案》[3]采取相關(guān)處理措施。

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