西鳳酒制酒車間環(huán)境微生物分布特征研究

徐 晨，白莉圓，張 艷，齊 歡，陳 雪，孟勤燕，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406）

空氣微生物是指空氣中細(xì)菌、霉菌和放線菌等有生命的活體，其主要來源是土壤、水體、動(dòng)植物和人類，另外，污水處理、動(dòng)物飼養(yǎng)、發(fā)酵過程和農(nóng)業(yè)活動(dòng)等也是空氣微生物的重要來源。懸浮于空氣中的微生物可形成各種各樣的微生物氣溶膠，并隨氣溶膠流動(dòng)而傳播和轉(zhuǎn)移。

我國固態(tài)白酒是在相對開放的環(huán)境中進(jìn)行生產(chǎn)的，空氣中的微生物是釀造微生物的主要來源之一。在西鳳酒傳統(tǒng)釀造工藝中，酒醅經(jīng)甑鍋餾酒后，在攤晾、下窖等過程時(shí)，空氣中大量懸浮的細(xì)菌和真菌孢子會(huì)以氣溶膠形式漂浮在適宜的介質(zhì)上快速生長，參與白酒發(fā)酵，對鳳香型白酒香味物質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用。其次，西鳳酒制酒車間空氣中的微生物經(jīng)過多年的富集和馴化，逐步形成了一個(gè)復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系，其微生物數(shù)量、種類、分布及其消長變化都會(huì)影響西鳳酒發(fā)酵途徑和終產(chǎn)物的生成。若能對西鳳酒生產(chǎn)環(huán)境中微生物分布狀況作深入的研究，無疑對總結(jié)鳳香型白酒風(fēng)味的形成機(jī)理、有效控制環(huán)境條件有著積極的作用。

因此，本課題對西鳳酒新老制酒車間空氣中真菌、細(xì)菌的組成和數(shù)量分布情況進(jìn)行了研究，以期了解新老制酒車間空氣微生物差異，并為研究穩(wěn)定釀酒微生態(tài)環(huán)境的技術(shù)措施提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 研究對象

以陜西西鳳酒廠5 個(gè)制酒車間（901、902、903、904、905）釀造環(huán)境為研究對象，其中901、902、903為老制酒車間，904 和905 為新制酒車間，各車間分別于同一年的每個(gè)月采樣。

1.1.2 試劑及耗材

PDA 培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；兩性霉素，上海源葉生物科技有限公司；NaCl，天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA，g/L）：馬鈴薯浸粉3、葡萄糖20、瓊脂14，在滅菌后倒平板前，加入兩性霉素100 μg/mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂0.5、葡萄糖10、氯霉素0.1、孟加拉紅0.033、瓊脂20。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂20。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏3、氯化鈉5。

上述培養(yǎng)基均以115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器設(shè)備

PTX-JA1000 型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；YXQ-IS-50A 型立式壓力滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-B11 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，SPX-250-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；FZ20 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采樣及計(jì)算

采取空氣沉降法對制酒車間的空氣進(jìn)行取樣，在各車間選取五點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)三個(gè)平行樣。將制作好的培養(yǎng)基平皿放置離地面50～60 cm 處，打開皿蓋暴露于空氣，以待空氣微生物降落在平板表面上。

孟加拉紅培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿在空氣中的暴露時(shí)間為1.5 min，取樣后以28 ℃±1 ℃培養(yǎng)48～72 h，分別觀察記錄酵母、霉菌的種群、數(shù)量；PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿在空氣中的暴露時(shí)間為2.5 min，取樣后以35 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀察記錄細(xì)菌的種群、數(shù)量。

采用國家標(biāo)準(zhǔn)確定的微生物計(jì)算公式計(jì)算空氣中微生物的濃度，公式如下:

式中：E，單位體積內(nèi)空氣微生物數(shù)，cfu/m；A，培養(yǎng)皿的面積，cm；T，培養(yǎng)皿暴露時(shí)間，min；N，培養(yǎng)皿中菌落數(shù)。

1.2.2 分離純化

采用平板劃線法進(jìn)行微生物分離，經(jīng)過反復(fù)多次的劃線操作得到單菌落。

1.2.3 鑒定方法

將各個(gè)菌種純化后送上海派森諾生物科技有限公司，使用測序儀ABI3730-XL 進(jìn)行DNA 測序。用NCBI Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，即為鑒定結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析，采用origin2018繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)空氣微生物數(shù)量分布差異

將取樣時(shí)間按春季（3—5 月）、夏季（6—8 月）、秋季（9—11 月）和冬季（12—2 月）劃分，對各季度3個(gè)月的微生物濃度求平均值，得到各制酒車間不同種類空氣微生物濃度季節(jié)變化情況見圖1—圖5。

圖1 901車間空氣微生物濃度季節(jié)變化

圖2 902車間空氣微生物濃度季節(jié)變化

圖3 903車間空氣微生物濃度季節(jié)變化

圖4 904車間空氣微生物濃度季節(jié)變化

圖5 905車間空氣微生物濃度季節(jié)變化

由圖1 可知，季節(jié)變化對901 車間的酵母菌濃度影響較大，不同季節(jié)的酵母菌濃度差異顯著。霉菌和細(xì)菌濃度隨季節(jié)變化規(guī)律基本一致，有下降的趨勢，在前三季度變化幅度較小，在冬季有較為明顯的下降。其次，除夏季外，其余三個(gè)季節(jié)酵母菌濃度均遠(yuǎn)高于霉菌和細(xì)菌濃度，且差異顯著。全年來看，901車間的酵母菌和細(xì)菌濃度都是春季最高，分別為2.96×10cfu/m和9.67×10cfu/m，夏季的酵母菌濃度最低，春季的酵母菌濃度是夏季的21倍。冬季的細(xì)菌濃度最低，春季的細(xì)菌濃度是冬季的13 倍。霉菌濃度變化幅度小，濃度最高達(dá)到6.34×10cfu/m，冬季最低，濃度為7.86×10cfu/m。

由圖2 和圖3 可知，902 和903 車間不同種類微生物的變化規(guī)律基本一致。季節(jié)變化對酵母菌濃度影響較大，春季和冬季的酵母菌濃度遠(yuǎn)高于其余季節(jié)，而霉菌和細(xì)菌濃度隨季節(jié)變化不明顯。其次，春季和冬季的酵母菌濃度與霉菌和細(xì)菌濃度差異顯著。全年來看，902 和903 車間春季的酵母菌濃度最高，分別為1.1×10cfu/m和3.87×10cfu/m，夏季的濃度最低，春季酵母菌濃度分別是夏季的30倍和168 倍。兩個(gè)車間春季的霉菌和細(xì)菌濃度較高且全年變化幅度較小，霉菌濃度最高分別達(dá)到7.22×10cfu/m和1.1×10cfu/m。細(xì)菌濃度最高分別達(dá)到1.26×10cfu/m和3.41×10cfu/m。

由圖4 和圖5 可知，904 和905 車間不同種類微生物的變化規(guī)律基本一致。不同于901、902、903三個(gè)老車間，兩個(gè)新車間秋季的酵母菌濃度最高，其次是春季和冬季，不同季節(jié)的酵母菌濃度有顯著差異。霉菌和細(xì)菌濃度隨季節(jié)變化規(guī)律基本一致，有上升的趨勢，但幅度很小，各季節(jié)之間差異不顯著。其次，除夏季外，其余三個(gè)季節(jié)的酵母菌濃度與霉菌和細(xì)菌濃度均差異顯著。全年來看，904和905車間秋季的酵母菌濃度最高，分別為2.16×10cfu/m和3.34×10cfu/m，夏季的濃度最低，秋季各新制酒車間酵母菌濃度分別是夏季的61倍和130倍。秋季霉菌濃度最高，分別為1.43×10cfu/m和1.32×10cfu/m，春季和夏季的霉菌濃度趨于一致。細(xì)菌濃度則隨著季節(jié)的變化，逐漸升高，在秋季達(dá)到最高，分別為2.14×10cfu/m和2.66×10cfu/m，春季最低，秋季各新制酒車間細(xì)菌濃度分別是春季的2.2 倍和3.0倍。

總體來看，各車間空氣微生物濃度均為酵母菌＞細(xì)菌＞霉菌，但新老車間存在明顯差異。老車間以春季微生物數(shù)量較多，新車間以秋季數(shù)量較多，這可能是由于下半年新制曲車間投產(chǎn)，對新車間的微生物數(shù)量影響較大。夏季微生物數(shù)量整體偏低。其主要原因是生產(chǎn)過程中，如起糟、拌料、撒曲、翻曲等環(huán)節(jié)，使附著有微生物（細(xì)菌、酵母、霉菌）的糟粒、曲粒懸浮于空氣中，從而增加了空氣中的微生物數(shù)量，而6 月底車間開始停產(chǎn)至8 月底，車間內(nèi)空氣流動(dòng)少，微生物數(shù)量隨之減少。建成最早、使用時(shí)間最久的老制酒車間901 的微生物濃度季節(jié)變化規(guī)律與其余4 個(gè)車間均不同。老制酒車間902 和903 建成時(shí)間一致，地理位置鄰近，其微生物季節(jié)變化規(guī)律也基本一致。同樣的，新制酒車間904 和905 在建成時(shí)間一致及地理位置鄰近的情況下，車間內(nèi)空氣微生物的季節(jié)變化規(guī)律也基本一致。

2.2 制酒車間可培養(yǎng)空氣微生物的種類分布情況

2.2.1 可培養(yǎng)空氣真菌分布情況

通過純化培養(yǎng)后，共挑選出了33 株真菌的單菌落進(jìn)行鑒定。由表1 可知，33 株菌株屬于真菌域的2 個(gè)門（Ascomycota 子囊菌門，Mucoromycota 毛霉亞門），5 個(gè)科（Aspergillaceae、Saccharomycopsidaceae、Cunninghamellaceae、Lichtheimiaceae、Rhizopodaceae），6 個(gè)屬（曲霉屬、青霉屬、復(fù)膜孢酵母屬、犁頭霉屬、橫梗霉屬、根霉屬）。多數(shù)菌屬于Mucoromycota門（22株，66.7%），其中Lichtheimiaceae 為優(yōu)勢科含16 株菌株，其次是Ascomycota 門（11 株，33.3 %），其中Aspergillaceae 為優(yōu)勢科含5 株菌株。陳雪等研究發(fā)現(xiàn)西鳳酒整個(gè)發(fā)酵過程中有子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota），其中Ascomycota 占絕對優(yōu)勢。由表2可知，新老制酒車間真菌種類差異不大。

表1 空氣中可培養(yǎng)真菌種類

表2 不同制酒車間空氣真菌種類分布

從鑒定結(jié)果來看，空氣中可培養(yǎng)真菌中的優(yōu)勢屬為橫梗霉屬（16 株，48.5 %），其中以傘枝橫梗霉和分枝橫梗霉數(shù)量最多。梗霉屬是非常重要的產(chǎn)酯酶菌，許多研究表明，橫梗霉是不同香型大曲的優(yōu)勢菌群之一。李良等研究發(fā)現(xiàn)一株分枝橫梗霉與釀造酒的酒曲混合，能夠提高基酒的雙乙酰含量，增加香味，以提高出酒率和優(yōu)品率。從空氣中分離出的酵母菌均為扣囊復(fù)膜孢酵母，該酵母雖然其產(chǎn)酒精能力不強(qiáng)，但香味濃郁，可使白酒風(fēng)味更加豐富，同時(shí)已有研究表明，扣囊復(fù)膜酵母能產(chǎn)α-淀粉酶，能分解生料和熟料淀粉，也能產(chǎn)生糖化酶，將淀粉分解為葡萄糖。復(fù)膜酵母菌屬是西鳳酒酒醅發(fā)酵過程中檢測出的主要存在的真菌類群。

2.2.2 可培養(yǎng)空氣細(xì)菌分布情況

通過純化培養(yǎng)后，共挑選出了117 個(gè)單菌落進(jìn)行鑒定。由表3可知，117株菌株屬于細(xì)菌域的2個(gè)門（Firmicutes 厚壁菌門，Proteobacteria 變形菌門），6 個(gè)科（Bacillaceae，Leuconostocaceae，Paenibacillaceae，Staphylococcaceae，Enterobacteriaceae，Erwiniaceae），10 個(gè)屬（芽孢桿菌屬，賴氨酸桿菌屬，普里斯特菌屬，腸桿菌屬，克雷伯氏菌屬，萊克雷氏菌屬，泛菌屬，明串珠菌屬，短桿菌屬，葡萄球菌屬）。多數(shù)菌屬于Firmicutes 門（78 株，66.7 %），其中Bacillaceae為優(yōu)勢科含74株菌株，其次是Proteobacteria 門（39 株，33.3 %），其中Enterobacteriaceae為優(yōu)勢科含30 株菌株。由表4 可知，新制酒車間空氣中的細(xì)菌種類比老車間多，老車間在生產(chǎn)過程中經(jīng)過長期的選擇和馴化，在空氣中形成了獨(dú)特且較穩(wěn)定的微生態(tài)區(qū)系，新車間不像老車間環(huán)境那樣對不同種群的微生物具有長期篩選作用，空氣的流動(dòng)性也相對較大，因此，微生物種群數(shù)量稍多。

表3 空氣中可培養(yǎng)細(xì)菌種類

表4 不同制酒車間空氣細(xì)菌種類分布

從鑒定結(jié)果來看，空氣中的細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬，尤其是以地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌居多?？諝庵醒挎邨U菌占總細(xì)菌數(shù)量的63.2%，其中地衣芽孢桿菌占所有芽孢桿菌數(shù)量的31 %。中國白酒是注重風(fēng)味的發(fā)酵食品，而產(chǎn)生這些特征風(fēng)味的核心因素還是微生物的作用，而芽孢桿菌在白酒釀造中對白酒風(fēng)味的影響自然成為學(xué)者研究的重點(diǎn)。芽孢桿菌是白酒發(fā)酵過程中極為重要的功能菌屬，并且能夠有效調(diào)節(jié)白酒的風(fēng)味。楊春霞等通過對分離出的芽孢桿菌發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生較多的酯類和含氮化合物，蠟狀芽孢桿菌與酯類和醛酮類化合物的合成關(guān)系更為緊密，而枯草芽孢桿菌的生成物中主要為雜環(huán)類化合物。其中地衣芽孢桿菌是白酒發(fā)酵中產(chǎn)酶、產(chǎn)風(fēng)味能力最強(qiáng)的菌株?？莶菅挎邨U菌為革蘭氏陽性嗜熱桿菌，已經(jīng)證實(shí)這類嗜熱芽孢微生物能產(chǎn)乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾。其次，據(jù)陳雪等的研究可知，芽孢桿菌屬是西鳳酒發(fā)酵入池酒醅細(xì)菌群落的重要組成之一，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符。由于西鳳酒生產(chǎn)過程中，酒醅在攤晾等過程中部分的自然接種主要來源于環(huán)境空氣中的微生物，其中優(yōu)勢菌群的影響更加明顯。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對西鳳酒不同制酒車間春、夏、秋、冬空氣中的酵母菌、霉菌、細(xì)菌的數(shù)量和種類進(jìn)行研究，得到以下結(jié)論：

（1）各制酒車間空氣中的三大類微生物數(shù)量均呈現(xiàn)酵母菌＞細(xì)菌＞霉菌的趨勢，每個(gè)制酒車間不同季節(jié)的酵母菌濃度差異顯著，霉菌和細(xì)菌差異較小。

（2）901 車間、902 和903 車間、904 和905 車間，以上三者的空氣微生物濃度呈現(xiàn)不同的季節(jié)變化規(guī)律，表明空氣微生物濃度受地理位置與車間投產(chǎn)時(shí)間先后的影響較大。后續(xù)可通過對比各車間的制酒產(chǎn)量及品質(zhì)，找尋空氣微生物與酒質(zhì)的關(guān)系，通過微生物控制來提升品質(zhì)。

（3）夏季停產(chǎn)前后車間內(nèi)空氣微生物數(shù)量差異顯著，表明夏季生產(chǎn)進(jìn)入挑窖及停產(chǎn)階段后對微生物數(shù)量影響較大，空氣微生物的數(shù)量與空氣流動(dòng)性密切相關(guān)。

（4）通過分離純化、物種鑒定得到117 株細(xì)菌和33 株真菌，其中，新制酒車間空氣微生物種類比老車間多，表明長期的生產(chǎn)過程對微生物的選擇和馴化對環(huán)境中穩(wěn)定的微生態(tài)區(qū)系的形成至關(guān)重要。

本研究分析了西鳳酒釀造環(huán)境的微生物分布特點(diǎn)，為穩(wěn)定釀酒微生態(tài)環(huán)境的技術(shù)措施提供基礎(chǔ)參數(shù)。而這僅僅是第一步，后續(xù)還需進(jìn)一步分析釀造環(huán)境空氣微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與酒醅微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，以及西鳳酒不同釀造車間基酒品質(zhì)的差異與微生物的關(guān)系，為深入揭示和闡明鳳香型白酒發(fā)酵機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。