梔子苷對結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡及Akt/MDM2/p53 通路的影響

于雅勤 沈加熙 張 虹

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)最常見、最致命的惡性腫瘤之一[1]。由于缺乏早期癥狀和有效的篩查策略，患者診斷時通常為晚期[2]。雖然CRC 分子靶向治療和免疫治療已取得重大進展[3]，但患者的預(yù)后仍較差。因此，尋找一種有效的CRC 治療方式并探索其潛在的調(diào)控機制十分必要。從藥用植物或草藥中提取的天然產(chǎn)物是治療CRC的重要補充療法[4]。梔子苷（geniposide，GEN）是一種類環(huán)烷苷，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性[5-6]。研究表明，GEN 通過阻斷HepG2 和HuH7 細胞Wnt/β-catenin 和AKT 級聯(lián)通路抑制細胞的增殖和促進細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。然而，GEN對CRC 的影響和作用機制仍不清楚。因此，本研究旨在探討GEN 對CRC 細胞增殖及凋亡的影響及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1試 劑 GEN（批號YRZ005，純度：≥98%）購自儀睿生物科技有限公司，胎牛血清（批號10099141C）、Dulbecco 改良Eagle’s 培養(yǎng)基（DMEM，批號11965092）購自美國Gibco 公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號11465007001）、二甲基亞砜（DMSO，批號276855）購自美國Sigma 公司，Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒（批號556419）購自BD Biosciences 公司，一抗p-Akt（sc-271964）、Akt（sc-81434）、p-MDM2（sc-53368）、p-p53（sc-135772）、p53（sc-393031）、MDM2（sc-5304）、cyclin B1（sc-7393）、Bcl-2（sc-7382）和β-actin（sc-47778）購自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2細胞來源及培養(yǎng) 人CRC 細胞系（HCT-8、SW-480、HT-29、DLD-1）和人永生化健康結(jié)腸細胞CCD-18Co 來自中國科學(xué)院（上海）細胞庫。細胞系置于含10%胎牛血清、1U/mL 青霉素G、1μg/mL 鏈霉素的DMEM，在37℃和5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)和維持。

1.3細胞活力測定 CRC 細胞（2×105細胞）和CCD-18Co 細胞（5×104細胞）接種于96 孔板中，用不同濃度（0～200μM）的GEN 孵育24h 或48h 后每孔加入30μL 的5mg/mL 四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液，37℃孵育4h，去掉培養(yǎng)液，加入150μL DMSO 溶解甲醛晶體。使用微板閱讀器在540nm 處讀取每個樣品的吸光度。計算所有細胞系的半數(shù)抑制濃度（IC50），其中一株細胞在進一步的實驗中被用來闡明GEN 的作用機制。

1.4流式細胞儀分析細胞凋亡與周期 收集SW480 細胞經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）GEN處理48h 后，用胰蛋白酶消化細胞，用PBS 洗滌，并在20℃的70%乙醇中固定過夜，然后與RNase（1mg/mL）孵育并用碘化丙錠（PI）（50μg/mL）染色。使用BD FACS Calibur 儀器通過流式細胞術(shù)確定DNA 含量。測定細胞凋亡時，用冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，在含有Annexin V-FITC 和PI 的300μL 溶液中，室溫黑暗中染色15min。隨后，用流式細胞術(shù)檢測熒光信號。Annexin V-FITC/PI 圖上象限定位用于區(qū)分活細胞（FITC-/PI-）、早期凋亡細胞（FITC+/PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（FITC+/PI+）。

1.5Western blot 分析 SW480 細胞經(jīng)GEN 處理48h 后，在裂解緩沖液中裂解30min。變性蛋白樣品（20μg）裝入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中。電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含10%脫脂牛奶的封閉液封閉后，用含0.1%（v/v）吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBS-T）洗滌，然后與一抗（1∶1000）在4℃孵育2h。用PBS-T 洗滌后，用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1h，最后，使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（GE Healthcare）可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.6Akt 基因敲低和轉(zhuǎn)染 為建立穩(wěn)定的AKT 基因敲低細胞，將慢病毒質(zhì)粒（shAKT1 和shAKT2）與包裝載體（psPAX2 和PMD2.G）用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞。用0.45μm 濾器過濾收集病毒顆粒，將病毒顆粒保存在-80℃中，用8μg/mL 聚乙烯胺（微孔）感染培養(yǎng)的CRC 細胞24h，然后用嘌呤霉素（1μg/mL）篩選36h，用于后續(xù)實驗。

1.7免疫熒光法 用TBS 洗滌細胞，4%多聚甲醛固定15min 后，用含0.1%Triton X-100 和1%牛血清白蛋白的1%牛血清白蛋白在37℃通透性封閉1h，然后與抗p53 抗體（1∶500）和MDM2 抗體（1∶500）共同孵育，在4℃輕度搖晃過夜。然后用PBS 洗滌細胞，分別與山羊抗兔（1∶500）和山羊抗鼠488（1∶500）二抗在室溫下孵育3h，最后用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核5min。用Leica SP2 共聚焦顯微鏡觀察細胞并拍照。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗至少一式三份進行，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。利用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。用單因素方差分析確定顯著性差異，然后進行Dunnett’s 事后檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GEN 對CRC 細胞株增殖的影響 以CRC 細胞株（HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1）和正常結(jié)腸細胞CCD-18Co 為實驗對象，采用MTT 法檢測GEN的抗癌作用。細胞中加入不同濃度（0、25、50、75、100、150 和200μM）的GEN，表1 顯示，與0μM GEN處理組比較，50、75、100、150 和200μM 的GEN 作用24h 和48h 后，CRC 細胞增殖受到抑制，并呈劑量依賴性（P 均＜0.05），25μM 的GEN 作用48h 后SW-480 和HT-29 細胞增殖抑制（P 均＜0.05）。此外，與處理24h 組比較，SW-480 和HT-29 細胞在75、100 和150μM 的GEN 處理48h 后細胞增殖抑制（P 均＜0.05），HCT-8 細胞在100 和150μM 的GEN 處理48h 后細胞增殖抑制（P 均＜0.05），DLD-1 在100 和200μM 的GEN 處理48h 后細胞增殖抑制（P 均＜0.05）。而在200μM 濃度范圍內(nèi)GEN 對正常細胞CCD-18Co 無顯著毒性。HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1 細胞在24h 和48h 的IC50 見表2，GEN 對SW-480 細胞的IC50 最低（P＜0.05），故進一步用于確定GEN 的作用機制，選擇濃度為0～150μM 的GEN 進行后續(xù)實驗。

表1 梔子苷（GEN）對SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 細胞活力的影響（n=3，）

表1 梔子苷（GEN）對SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 細胞活力的影響（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 為人結(jié)腸癌細胞；DLD-1 為人結(jié)直腸腺癌上皮細胞；CCD-18Co 為人結(jié)腸組織細胞；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05；與處理24h 組比較，bP<0.05

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半數(shù)抑制濃度（IC50）（n=3，）

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半數(shù)抑制濃度（IC50）（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 為人結(jié)腸癌細胞；DLD-1 為人結(jié)直腸腺癌上皮細胞；與SW-480 細胞比較，aP<0.05

2.2GEN 對SW-480 細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測GEN 對SW-480 細胞凋亡的影響，圖1A 和表3 顯示，GEN（50、100、150μM）處理48h 后，凋亡細胞百分率顯著增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。此外，與0μM GEN 處理組比較，GEN 處理可以顯著增加凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 表達（P＜0.05），見圖1B和表4。

2.3GEN 對SW-480 細胞周期的影響 GEN（100和150μM）作用48h 后，SW-480 細胞周期阻滯于G2-M 期（P＜0.05，見圖1C 和表3），細胞周期蛋白cyclin B1 表達下降（P＜0.05，見圖1D 和表4）。

圖1 梔子苷（GEN）對SW-480 細胞凋亡和細胞周期的影響

表3 梔子苷（GEN）對SW-480 細胞凋亡和細胞周期的影響（n=3，）

表3 梔子苷（GEN）對SW-480 細胞凋亡和細胞周期的影響（n=3，）

注：人結(jié)腸癌細胞SW-480 經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）的梔子苷（GEN）作用48h；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05

表4 SW480 細胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相對蛋白表達水平（n=3，）

表4 SW480 細胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相對蛋白表達水平（n=3，）

注：人結(jié)腸癌細胞SW-480 經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）的梔子苷（GEN）作用48h；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05

2.4GEN 對Akt/MDM2/p53 信號通路的影響 GEN下調(diào)CRC 細胞系A(chǔ)kt 和MDM2 蛋白表達，并激活p53 蛋白表達（P＜0.05，見圖2 和表4），為了研究GEN 對細胞增殖的抑制是否依賴于Akt 蛋白的表達，通過用含有pLKO 或shRNA-Akt1/2 的慢病毒載體感染細胞來進行Akt 的敲低（見圖3A），CRC 細胞Akt1/2 的敲低導(dǎo)致細胞增殖減少（見圖3B），而GEN處理無法進一步抑制shRNA-Akt1/2 細胞中的增殖能力（見圖3C）。免疫熒光染色顯示，GEN 下調(diào)CRC細胞系MDM2 表達，并激活p53，與pLKO 組比較，Akt1/2 敲低后MDM2 被抑制，而p53 被激活（見圖3D）。

圖2 GEN 對Akt/MDM2/p53 信號通路的影響

3 討論

藥用植物天然產(chǎn)物具有高效低毒的特點，GEN是梔子的主要生物活性成分之一，具有抗炎和抗腫瘤等重要的治療作用。此外，GEN 有效發(fā)揮胃腸疾病保護劑的作用[8]，其通過抑制炎癥和黏膜損傷減輕結(jié)腸炎[9]，研究證明，GEN 可以預(yù)防和治療炎癥驅(qū)動的疾病，包括癌癥[6，10]。據(jù)報道，GEN 能抑制癌細胞增殖和促進其凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。在胃癌中，GEN 治療也對癌細胞的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)GEN 可抑制CRC 細胞的增殖，而對Ccd-18Co 細胞的生長無明顯影響。這與之前的研究一致，提示GEN 的抗腫瘤活性，但對正常細胞無毒且安全[7]。此外，我們發(fā)現(xiàn)GEN 可誘導(dǎo)CRC 細胞發(fā)生G2/M 期阻滯和凋亡。已有研究報道，GEN 對彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞的增殖和凋亡抵抗具有抑制作用[12]。然而，尚不清楚GEN 如何參與CRC 中細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。

Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱為蛋白激酶B（PKB），其抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)糖原代謝，促進癌癥進展，磷酸化Akt 的過表達是惡性腫瘤治療的一個靶點[13]。以往的研究表明，Akt/MDM2/p53 信號通路對細胞凋亡有相當(dāng)大的影響，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。本研究中GEN 抑制CRC 細胞Akt/MDM2/p53 信號通路。據(jù)報道，Akt 信號通路的異常激活與CRC 的進展密切相關(guān)，盡管一些Akt 抑制劑已經(jīng)用于治療CRC，然而Akt 作為CRC 靶點的報道很少。本研究中，Akt 敲低顯著抑制CRC 細胞的生長，這與之前的報告一致[15]。此外，p53 在多細胞生物體中扮演著重要的腫瘤抑制因子的角色，在癌癥發(fā)展和其功能障礙可能有助于快速細胞增殖和減少DNA 修復(fù)能力[16]。本研究還證明，GEN 可以增加p53 和Bax蛋白的表達，并降低Bcl-2 蛋白的表達。

據(jù)報道，AKT 磷酸化可以促進轉(zhuǎn)錄因子MDM2的穩(wěn)定和核易位，從而引發(fā)隨后的腫瘤抑制因子p53的泛素化和降解[17]。本研究中Akt1/2 基因敲除抑制MDM2 和p53 表達。因此，GEN 可能通過抑制Akt 介導(dǎo)的MDM2 磷酸化來激活p53 介導(dǎo)的通路，從而有助于抑制CRC 細胞增殖和促進細胞凋亡。

綜上所述，GEN 抑制CRC 細胞增殖和誘導(dǎo)G2/M 期阻滯和凋亡，其作用機制可能通過Akt/MDM2/p53 途徑，從而發(fā)揮抗癌作用，即GEN 抑制Akt 介導(dǎo)的MDM2 和p53 激活，從而抑制人CRC 細胞的增殖。但是目前研究尚缺乏在生物體內(nèi)的驗證，希望能在后續(xù)研究中增加體內(nèi)實驗，以充分評估GEN 對生物體的安全性和治療有效性。