基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS代謝組學的不同產地酸棗仁化學成分差異性比較△

黃曉欣，毛怡寧，李虹，王宇航，劉勇

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100102

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，始載于《神農本草經》，味酸，性平，主治心腹寒熱、邪結氣聚、四肢酸疼濕痹，久服安五臟[1]。酸棗仁廣布全球，在中國主要分布于北方大部分地區(qū)，如河北、陜西、遼寧、河南等省。失眠又稱睡眠障礙性疾病，主要表現(xiàn)為難以入睡，持續(xù)睡眠困難等癥狀，并產生一些不適的感覺，如疲憊、頭痛及注意力不佳等，嚴重影響患者的生活質量。酸棗仁為中醫(yī)治療失眠的常用藥物，其需求量也隨之不斷增加。然而，酸棗仁廣泛分布于北方低山丘陵地區(qū)，目前多為野生，少數(shù)栽培的酸棗管理較為粗放。不同產地間生態(tài)環(huán)境與栽培管理等因素使得藥材中的各類成分差異較大，導致不同地區(qū)酸棗仁品質存在顯著的差異。

目前，已從酸棗仁中分離鑒定了190 余個化學成分，包括皂苷類、黃酮類、三萜類、生物堿類、脂肪油類、甾體類、酚酸類化合物、多種氨基酸和微量元素等。酸棗仁中的皂苷類、黃酮類和生物堿類成分較受關注，其中現(xiàn)代藥理研究主要集中在皂苷類成分，其鎮(zhèn)靜催眠作用已被廣泛認可。酸棗仁總皂苷質量分數(shù)約為0.091 6%，主要包括四環(huán)三萜和五環(huán)三萜2 種[2]，如從酸棗仁甲醇提取部位中得到的酸棗仁皂苷A（jujuboside A）和酸棗仁皂苷B（jujuboside B）。酸棗仁總黃酮質量分數(shù)為0.95%，主要為芹菜素型黃酮碳苷類化合物[3]。Woo 等[4]首次從酸棗仁甲醇提取部位分離得到斯皮諾素（spinosin）黃酮碳苷及其?；苌?，并確定其結構，此后從酸棗仁甲醇提取物中分離出葛根素（puerarin）、異斯皮諾素（isospinosin）、異牡荊素（isovitexin）、酸棗黃素（zivulgari）等黃酮類化合物。酸棗仁中生物堿類成分含量相對較高。目前已從酸棗仁中分離鑒定出26 個生物堿，主要分為吡咯類、吲哚類、異喹啉類和環(huán)肽類。最先從酸棗仁中分離得到的生物堿為lysicamine 和juzirine，后來發(fā)現(xiàn)還有環(huán)肽類生物堿、酸棗仁堿A、酸棗仁堿B、酸棗仁堿D、酸棗仁堿F、酸棗仁堿G1、酸棗仁堿G2和阿樸菲類生物堿酸棗仁堿E、酸棗仁堿Ⅰa、酸棗仁堿Ⅰb、酸棗仁堿K等。

酸棗仁的質量控制手段主要有多指標成分含量測定及指紋圖譜整體控制2 種?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版將斯皮諾素、酸棗仁皂苷A 作為酸棗仁檢測的指標成分。隨著分析手段和儀器的不斷發(fā)展，關于酸棗仁質量控制研究的熱點逐漸由多指標成分含量測定向指紋圖譜整體評控方向轉移。溫度、光照、濕度等氣候因素會導致不同產地酸棗仁次生代謝產物的積累不同，進而導致藥材質量差別。因此，研究酸棗仁不同產地的質量差別對于保證藥材質量和建立酸棗仁良好農業(yè)規(guī)范（GAP）基地是十分必要的。

目前，產地因素對酸棗仁內在化學成分影響的研究多為利用高效液相色譜法、紫外分光光度法等對斯皮諾素，酸棗仁皂苷A、B 等幾個指標成分進行定性、定量分析。而中藥為復雜的化學體系，僅靠幾個指標性成分不能全面體現(xiàn)其品質差異。另外，色譜分析法依賴對照品，對中藥材中含量較低的化學成分難以檢測，定量分析的化合物也比較有限，難以反映其化學成分的代謝譜。近年來，隨著超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質譜法（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）代謝組學技術的發(fā)展，為中藥的區(qū)分或差異性評價及中藥質量評控提供了一種可靠的方法[5]。

本實驗基于植物代謝組學技術的發(fā)展，利用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS 結合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）對不同產地酸棗仁的差異性進行鑒別分析，為不同地理位置酸棗仁中化學成分差異性及品質多樣性的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific LTQ-Oribitrap XL 型線性離子阱-串聯(lián)靜電場軌道阱質譜儀，配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1化學工作站；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused型超高效液相色譜系統(tǒng)，含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列（DAD）檢測器；Chromeleon 7 工作站；Millipore Synergy UV 型超純水機（美國Millipore公司）；R200D型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

對照品蘆?。ㄅ枺篩06J8S37439）、山柰酚（批號：R03F6C1）、葛根素（批號：YM051DYA14）、斯皮諾素（批號：P01N8F47228）、酸棗仁皂苷A（批號：P08A8F33617）均購于上海源葉生物科技有限公司；對照品酸棗仁皂苷B（批號：110814-200607）購于中國食品藥品檢定研究院，所有對照品純度均≥98%；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fishier Scientific 公司）；其余試劑均為分析純。

樣品采自遼寧、河北、山西、陜西、河南5 個產區(qū)的10 個不同產地，經北京中醫(yī)藥大學劉勇教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。樣品詳細采集信息見表1。

表1 酸棗仁樣品來源

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取各產地酸棗仁粉末（過四號篩）約l g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉移至錐形瓶中，加70%乙醇20 mL，超聲2 h，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL 洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.2 質量控制（QC）樣品制備

分別精確吸取按2.1 項下制備的10 個產地共34 份樣品，等容混勻，經微孔濾膜（0.22 μm）濾過，置于液相色譜小瓶中，即得QC 樣品。在樣品分析前連續(xù)進樣5次同一QC 樣品，在運行樣品序列中每間隔10個樣品運行1次QC樣品。

2.3 色譜與質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-Cl8（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5.0%～20.0 %A；5～10 min，20.0%～22.5%A；10～12 min，22.5%～48.0%A；12～15 min，48.0%～58.0%A；15～35 min，58.0%～90.0%A；35.0～35.1 min，90.0%～5.0%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣量為4 μL。

質譜參數(shù)：加熱電噴霧離子源（HESI），正、負離子檢出模式，掃描范圍：m/z50～1800；離子源溫度：350 ℃；電離源電壓：4 kV；毛細管電壓：35 V；管透鏡電壓：110 V；鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99.99%）；鞘氣流速：40 arb，輔助氣流流速：20 arb；數(shù)據(jù)采集采用傅里葉變換高分辨全掃方式（TF，F(xiàn)ull scan，Resolution 30 000）、數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS 2、母離子列表PIL-MS2 等多種采集策略，碰撞誘導裂解（CID）條件。

2.4 代謝物定性及數(shù)據(jù)分析

基于代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫及對照品對比，對質譜檢測的一級精確相對分子質量及二級碎片離子信息進行色譜峰歸屬的定性分析。使用SIEVE 2.1軟件對原始數(shù)據(jù)進行峰檢測、篩選、對齊、濾噪等預處理，得到二維峰原始數(shù)據(jù)矩陣，并對數(shù)據(jù)進行歸一化預處理。使用SIMCA 14.0軟件對數(shù)據(jù)進行標準化處理，隨后進行PCA 無監(jiān)督模式識別、OPLSDA有監(jiān)督模式分析，并通過排列置換檢驗的方法來檢驗模型是否過擬合。根據(jù)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）對組間分離貢獻大的化合物進行初步篩選（VIP 值＞1），并結合獨立樣本t檢驗（P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義）篩選潛在的差異標記化合物。

3 結果

3.1 酸棗仁成分鑒別

酸棗仁代謝產物的質譜數(shù)據(jù)和結構鑒定結果見表2，結合本課題組前期實驗[6]，通過高分辨質譜及二級質譜的碎片離子推測化合物的結構式，再根據(jù)部分對照品信息、相關文獻及色譜峰進行推斷鑒定，共表征49 個化合物，包括27 個黃酮類、14 個皂苷類、6 個三萜類、2 個生物堿類，其中christinin D、jujubasaponin Ⅰ、jujubasaponin Ⅵ、ziziberanalic acid 為首次從酸棗仁中檢測到。并采用Mass Frontier 和Metwork 工具對可能存在的新化合物進行了預測，共推測出9 個新成分。

表2 酸棗仁代謝產物的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS分析結果

續(xù)表2

續(xù)表2

表2 中化合物christinin D、jujubasaponin Ⅰ、jujubasaponin Ⅵ，zizyberanalic acid 為首次從酸棗仁中檢測到。酸棗仁中皂苷類成分的質譜行為主要為依次脫去糖基，根據(jù)裂解規(guī)律結合文獻進行推測結構。以化合物48 為例，質譜給出準分子離子峰m/z1 044.550 0 [M-H]-，可推斷其分子式C52H85O21，以m/z1 044.550 0 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z911 [MH-Xyl]-為母離子丟失1分子木糖產生，之后連續(xù)丟失1分子葡萄糖、1分子鼠李糖及1分子阿拉伯糖產生的碎片離子m/z749，603，453。m/z893[M-H-H2OXyl]-，747 [M-H-H2O-Xyl-Rha]-為母離子丟失1 分子水，繼而脫去1分子木糖及1分子鼠李糖形成的碎片離子。結合文獻推測此化合物為christinin D。

化合物51 為jujubasaponin Ⅰ。質譜給出準分子離子峰m/z941.510 4 [M-H]-，可推斷其分子式C47H76O16，以m/z941.510 4 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z895[M-H-2CH3-H2O]-，為母離子脫去1 分子水和2 分子甲基，繼而丟失1 分子鼠李糖、1 分子葡萄糖、1 分子阿拉伯糖形成碎片離子453。結合文獻推測此化合物51 為jujubasaponin Ⅰ。相同裂解方式結合文獻可推測化合物52為棗樹皂苷Ⅵ。

化合物56為zizyberanalic acid，質譜給出準分子離子峰m/z469.331 2 [M-H]-，可推斷其分子式C30H46O4，以m/z469.331 2作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z451[M-H-H2O]-，423[M-H-CO-H2O]-，401[MH-2CH3-H2O]-，結合文獻推測該化合物為zizyberanalic acid。

表2 中化合物6、7、9、10、15、16、29、30、34 為推測出的新成分?；衔?、7、9 質譜給出準分子離子峰分別為m/z919.250 3[M-H]-，889.239 7[M-H]-，975.276 5[M-H]-，可推斷其分子式分別 為C42H48O23、C41H46O22、C45H52O24。分 別以m/z919.250 3，889.239 7，975.276 5 作為母離子進行二級質譜分析?；衔? 所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z757 [M-H-Glc]-，之后再裂解成607[M-H-60-90]-，595[M-H-Glc]-，427[MH-90-120-120]-?；衔?、9 所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z607，427，294 碎片離子，具有與斯皮諾素（spinosin）相似的質譜行為和紫外光譜吸收，有規(guī)律地產生脫去m/z60，90，120 質量單位的碎片峰。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律（圖1），推測化合物6、7、9 分別為6?-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-香草酰斯皮諾素、6?-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-對羥基苯甲酰斯皮諾素、6"′-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-芥子酰斯皮諾素。

圖1 斯皮諾素可能的裂解途徑

化合物10 質譜給出準分子離子峰m/z725.192 4[M-H]-，可推斷其分子式C32H38O19，以m/z725.192 4 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z593[M-H-Xyl]-，575[M-H-Xyl-H2O]-為母離子脫去1分子木糖產生的碎片離子，繼而丟失1分子葡萄糖和1分子鼠李糖形成碎片離子431[M-H-Xyl-Glc]-，285[MH-Xyl-Glc-Rha]-。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→6）-β-D-O-吡喃鼠李糖基-O-β-吡喃木糖苷。

化合物15 質譜給出準分子離子峰m/z903.255 4[M-H]-，可推斷其分子式C41H46O21，以m/z903.255 4 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z857[M-H-H2OCO]-，757 [M-H-Rha]-，741 [M-H-Glc]-；417 [M-H-Glc-CO-120]-為m/z741 丟失1 分子CO 和1 分子葡萄糖形成的碎片離子。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為6?-（4"′′-O-β-D-吡喃鼠李糖基）-香草酰斯皮諾素。

化合物16質譜給出準分子離子峰m/z649.1763 1[M-H]-，可推斷其分子式C30H34O16，以m/z649.176 3作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z607[M-H-AC]-，445 [MH-Glc]-，427[M-H-Glc-H2O]-，367[M-HGlc-H2O-60]-，325 [M-H-120-Glc]-，307[M-H-Glc-H2O-120]-。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為6?-乙酰斯皮諾素。

化合物29 質譜給出準分子離子峰m/z711.192 0[M-H]-，可推斷其分子式C35H36O16，以m/z711.192 0 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z589[M-H-CH2-H2O-90]-，557[M-H-CH2-H2O]-，445[M-HH2O]-，427[M-H-2H2O]-，307[M-H-2H2O-120]-。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為6?-苯甲酰斯皮諾素。

化合物30 質譜給出準分子離子峰m/z691.223 3[M-H]-，可推斷其分子式C33H40O16，以m/z691.223 3 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z607[M-H-2AC]-，589[M-H-H2O]-，571[M-H-H2O]-。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為6?-O-（2"′′-甲基丁酰基）阿魏酰斯皮諾素。

化合物34 質譜給出準分子離子峰m/z961.276 1[M-H]-，可推斷其分子式C48H50O21，以m/z961.276 1 作為母離子進行二級質譜分析。所得二級質譜圖中有明顯的碎片離子m/z943[M-H-H2O]-，931 [M-H-2CH3]-，m/z932 丟失1 分子葡萄糖和2 分子水后形成碎片離子407 [M-H-Glc-2H2O-90-120-120]-，307[M-H-Glc-AC-60-120-120-120]-，有規(guī)律地產生脫去60，90，120質量單位的碎片峰。結合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測此化合物為6"-對香豆?；?6?-芥子酰斯皮諾素。

3.2 PCA與OPLS-DA結果

3.2.1 系統(tǒng)方法評價 整個實驗過程中，所有QC樣品中化合物的保留時間RSD值均小于1%，峰強X射線衍射（XRD）值＜30%，說明儀器精密度、重復性符合要求；在無監(jiān)督的PCA中，在樣品序列運行中插入的QC樣品緊密聚集在一起（圖2），說明儀器穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)質量良好，可對數(shù)據(jù)進行進一步分析。

圖2 不同產地酸棗仁醇提物PCA得分

3.2.2 PCA PCA 是指在海量的原始數(shù)據(jù)中篩選出少數(shù)幾個具有代表性的主成分，根據(jù)主成分作圖以直觀地描述樣品整體的分類趨勢及不同組別之間的聚類情況[29-30]。從圖2 可以看出，5 個產地的酸棗仁樣品均分別聚集為一類，分類趨勢較為明顯。

3.2.3 OPLS-DA OPLS-DA 被廣泛用于代謝組數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選[31]。為了更好地觀察不同產地樣品間的組內差異，在PCA 分組的基礎上，進一步進行有監(jiān)督的OPLS-DA，獲得相應模型，OPLS-DA 得分見圖3。由圖3 可知，10 批酸棗仁樣品大致聚集分為4 組[遼寧、華北（河北、山西）、陜西、河南]，表明4 組藥材中的化學成分存在差異。從模型驗證的參數(shù)圖可知，模型的穩(wěn)定性和交叉驗證的預測力都較高（Q2=0.956，R2Y=0.989，R2X=0.85），說明所建立的OPLS-DA 模型可以很好地用于下一步的分析，即不同產地酸棗仁的差異代謝物分析。

圖3 不同產地酸棗仁醇提取物OPLS-DA結果

3.3 差異代謝物的篩選

為鑒定不同產地酸棗仁中化學代謝物的差異情況，采用OPLS-DA 對陜西、河南、遼寧、華北4 組酸棗仁樣品分別兩兩組合進行OPLS-DA，并根據(jù)VIP 值結合t檢驗篩選差異標志物，以VIP＞1，P＜0.05為篩選標準（圖4）。

圖4 不同產地酸棗仁醇提取物差異代謝物比較的OPLS-DA結果

根據(jù)VIP 值及t檢驗結果結合前面所鑒定的58 個化學成分，篩選鑒定產地間差異標記化合物，結果表明34 個化學成分在陜西和河南樣品間差異有統(tǒng)計學意義；26 個化學成分在陜西和華北樣品間差異有統(tǒng)計學意義；15 個化學成分在陜西和遼寧樣品間差異有統(tǒng)計學意義；33個化學成分在遼寧和華北樣品間差異有統(tǒng)計學意義；39個化學成分在河南和華北樣品間差異有統(tǒng)計學意義；33個化學成分在河南和遼寧樣品間差異有統(tǒng)計學意義，見表3。結果表明，外在環(huán)境因素對不同產地酸棗仁的差異代謝物存在一定的影響，因此統(tǒng)計了不同產地的氣候信息，見表4。

表3 各產地酸棗仁的差異代謝物

表4 酸棗仁各產地氣候信息

4 討論

酸棗仁作為一種常用中藥，其藥材的質量直接影響到湯劑的質量與療效，而不同產地的藥材質量差異往往較大，因此評價不同產地酸棗仁藥材的質量，優(yōu)選產地也是保證酸棗仁相關湯劑質量的重要手段之一。本研究采用基于UHPLC-ESI-MS/MS 的代謝組學方法對不同產地酸棗仁的化合物進行分析，結合文獻共鑒別出58 個化合物，其中檢測到9 個新成分；再利用PCA、OPLS-DA 篩選出不同產地酸棗仁中的差異標記代謝物，結果顯示不同產地的酸棗仁中化學成分是有差異的。

本實驗中相對于各產地間差異代謝物含量都有顯著性差異的有黃酮類及三萜酸類2 種，包括山柰酚-3-O-蕓香糖苷、6"′-對羥基苯甲酰斯皮諾素及美洲茶酸3 個化合物，可作為潛在的質量標志物區(qū)分以上不同產地酸棗仁，但中藥作為一種復雜的化學體系，僅靠幾個指標性成分也不足以全面體現(xiàn)其品質差異，因此最好是能結合其他指標性成分進行分析。河南產地與陜西、遼寧、華北產地的差異標記物中，其黃酮類成分特別是黃酮碳苷類成分、皂苷類成分含量較低。有大量研究認為，紫外輻射、高光強、低溫、干旱等條件可能促進黃酮的合成。其中光照、溫度的影響最大，可對黃酮合成途徑中關鍵酶[如查耳酮合成酶（CHS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等]的活性產生直接影響，從而影響植物中黃酮類成分的含量[32-33]。此外酸棗仁的“搶青”現(xiàn)象較嚴重，不同產地酸棗成熟時間不同，采收期也會對酸棗仁中化學成分產生影響[34]。本實驗中河南酸棗仁樣品采集于河南南部的南陽、平頂山地區(qū)，這些地區(qū)降水量、平均相對濕度、平均氣溫均高于其他地區(qū)，這些氣候因素可能會對酸棗仁中黃酮類、皂苷類成分積累產生一定抑制作用。

另外，結果表明不同產地間的溫度、光照、降水、土壤等環(huán)境因子對酸棗仁化學組成是有一定影響的，但這些差異代謝物對于不同產地酸棗仁質量高低、湯劑中酸棗仁用量與臨床療效之間的關系還有待進一步研究。該研究結果為評價不同產地酸棗仁質量提供了一種可行的方法，也為進一步研究環(huán)境因子對酸棗仁品質的影響提供了有關的基礎研究數(shù)據(jù)。