基于葉綠體DNA序列的多基原黃精分子鑒定

叢悅，李莉，張金霞，關(guān)佳莉，拱健婷，王大仟，趙藝萌

北京市臨床藥學(xué)研究所，北京 100035

黃精屬（Polygonatum）是百合科（Liliaceae）多年生草本植物，該屬植物種類繁多，全世界分布約60 個(gè)種，我國有39 個(gè)種，其中黃精Polygonatum sibiricumRed.、多花黃精P.cyrtonemaHua.和滇黃精P.kingianumColl.et Hemsl.是《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中規(guī)定黃精藥材的基原植物[1]，此外另有20 余種該屬植物可在不同的地區(qū)入藥?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定的3 種黃精基原分布廣泛，沒有十分明顯的地域性，地理分布區(qū)有重疊。近年來，通過引種栽培也人為地?cái)U(kuò)大了黃精的生長區(qū)域，增加了各類群間性狀交叉和種質(zhì)混雜。

黃精味甘，性平，具有健脾、滋陰和潤肺等功能，其含有的主要化學(xué)成分包括多糖、甾體皂苷、黃酮、氨基酸等生物活性物質(zhì)，具有提高免疫力、調(diào)血脂、降血糖、抗病毒、抗衰老和抑菌等廣泛的藥理活性，并具有食用價(jià)值[2-3]。不同基原黃精的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有較大的差異，何俊婷等[4]對(duì)3 種基原黃精中多糖含量測定發(fā)現(xiàn)，多花黃精中多糖含量最高，其次是滇黃精和黃精。藥效成分差異亦導(dǎo)致藥理作用、開發(fā)利用等方面的不同，因此對(duì)黃精基原的鑒別具有重要意義。母系遺傳的葉綠體matK、psbAtrnH、rbcL等基因由于進(jìn)化速度快，引物通用性好等特點(diǎn)，常被應(yīng)用于中藥材分子鑒定。楊培等[5]評(píng)價(jià)了葉綠體rbcL、matK、psbA-trnH序列，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）和ITS 序列對(duì)黃精屬植物的鑒定能力，結(jié)果表明，由于鑒定效率低，這些候選條形碼序列均不適合該屬植物的鑒定。Rpl20-rps12序列是葉綠體50S大亞基中編碼基因L20與核糖體蛋白編碼基因S12之間的基因間隔區(qū)序列，具有較髙進(jìn)化速率，能提供豐富的信息位點(diǎn)，常用來解決在屬下種間及近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[6]。葉綠體DNA（cpDNA）trnL-trnF序列在進(jìn)化上具有選擇壓力小和進(jìn)化速率較快的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物科間、屬間或種間親緣關(guān)系及種內(nèi)譜系地理學(xué)研究[7]。本研究收集來自遼寧、陜西、山西、浙江、廣西、云南的3 種不同基原黃精，以藥用部位根狀莖為DNA 提取材料，比較分析rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列的分子特點(diǎn)和變異情況，為黃精基原鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

本研究所用23份樣品包括黃精10份、多花黃精8 份、滇黃精5 份，均為根狀莖。采自遼寧、山西、陜西、浙江、廣西、云南。樣品由北京市中藥研究所李莉研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于北京市中藥研究所（表1）。

表1 3種基原黃精采集信息

1.2 儀器與試劑

AB135-S 型分析天平（Mettler 公司）；Milli Q Biocel型純水儀（Millipore公司）；3K15型通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma 公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（皓莊儀器有限公司）；EasyCycler 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Analytik Jena 公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；C150 型凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems公司）。

多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；超強(qiáng)高保真PCR試劑盒（天根生化科技有限公司）；rpl20-rps12引物（正向：5′-TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3′，反 向：5′-GTCGAGGAACATGTACTAGG-3′）、trnL-trnF引物（正向：5′-GGTTCAAGTCCCTCTATCCCC-3′，反 向：5′ -ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′）、psbA-trnH引物（正向：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，反向：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′）[8]均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 基因組總DNA提取

分別取根狀莖材料0.1 g放入預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨成細(xì)粉。采用多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行總DNA 提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取結(jié)果，分光光度計(jì)測DNA 的濃度和純度。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

通過設(shè)定溫度梯度確定各序列片段最佳退火溫度，rpl20-rps12為54 ℃，trnL-trnF為56 ℃，psbAtrnH為55 ℃。參照超強(qiáng)高保真試劑盒說明，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL 體系中完成，反應(yīng)體系：滅菌雙蒸水（ddH2O）10.2 μL，2×Ultra HiFi Mix 15 μL，引物各2.5 μmol·L-1，DNA 模板20 ng。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s；54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示為單一明亮擴(kuò)增條帶，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司雙向測序。

2.3 序列分析及數(shù)據(jù)處理

測序峰圖使用ContingExpress軟件進(jìn)行正反比對(duì)并手工校正，經(jīng)ClustalX 1.81[9]比對(duì)排列，去除前后兩端低質(zhì)量區(qū)。MEGA 5[10]軟件以K2-P（Kimura 2-parameter）模型計(jì)算不同種間和種內(nèi)遺傳距離，每個(gè)物種內(nèi)所有樣本的K2-P距離即為種內(nèi)遺傳距離，3種基原黃精的K2-P距離即為種間遺傳距離。1000次重復(fù)自展程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤檢測，采用鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹構(gòu)建基于K2-P距離的群體聚類圖。

3 結(jié)果

3.1 葉綠體基因的序列特征

共擴(kuò)增23 份材料的3 個(gè)cpDNA 基因序列（rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH）69 條，均獲得單一、清晰、明亮的特異性條帶，PCR 擴(kuò)增率和測序成功率均為100%，凝膠電泳結(jié)果見圖1。采用MEGA 5 軟件計(jì)算序列長度、鳥嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比、堿基變異數(shù)、簡約信息位點(diǎn)個(gè)數(shù)和序列插入/缺失情況，見表2。所測樣品rpl20-rps12序列長度為722～737 bp，有3 個(gè)變異位點(diǎn)，平均G+C 占比為34.0%，簡約信息位點(diǎn)3 個(gè)，占比0.4%，3 處存在1～9 bp 插入/缺失位點(diǎn)。所測樣品的trnL-trnF的序列長度為293 bp。共3 個(gè)變異位點(diǎn)，平均G+C 占比為31.5%，簡約信息位點(diǎn)3個(gè)，占比1%，無插入/缺失位點(diǎn)。所測樣品的psbA-trnH的序列長度為457～531 bp，共11 個(gè)變異位點(diǎn)，平均G+C 占比為34.1%，簡約信息位點(diǎn)有11個(gè)，占比2.4%，在97 bp處有1個(gè)長度為74 bp的插入/缺失位點(diǎn)。

表2 黃精3個(gè)葉綠體DNA序列基本特征

圖1 黃精樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶

3.2 種間和種內(nèi)遺傳距離分析

23 份黃精樣品進(jìn)行種間及種內(nèi)遺傳距離分析，結(jié)果見表3。rpl20-rps12序列3 個(gè)物種的種間距離均為0.002 7 bp，每個(gè)物種的種內(nèi)遺傳距離均為0。trnL-trnF序列種間遺傳距離差異最大，多花黃精和滇黃精之間有最大遺傳距離0.008 9 bp，黃精和滇黃精遺傳距離最小，為0.003 3 bp。黃精和滇黃精的種內(nèi)遺傳距離為0，多花黃精的種內(nèi)遺傳距離為0～0.003 8 bp。psbA-trnH序列種間最大遺傳距離是黃精和滇黃精之間，為0.022 2 bp，黃精和多花黃精的種間遺傳距離最小為0.002 4 bp。黃精和滇黃精的種內(nèi)遺傳距離為0，多花黃精的種內(nèi)遺傳距離為0～0.001 8 bp。

表3 3種基原黃精K2-P遺傳距離bp

3.3 聚類分析

使用MEGA 5 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。rpl20-rps12序列可將黃精、多花黃精和滇黃精完全分開，支持率分別為64%、65%和62%。trnL-trnF序列鑒別黃精、多花黃精和滇黃精的支持率分別為66%、66%和63%，同樣具有較好的鑒別能力，廣西桂林多花黃精與遼寧、浙江多花黃精有較遠(yuǎn)的遺傳距離，獨(dú)立聚為1 支。psbA-trnH序列也有很好的鑒別能力，對(duì)黃精、多花黃精和滇黃精的支持率分別為63%、67%和100%。

圖2 基于不同葉綠體DNA序列的黃精樣品NJ樹

4 討論

對(duì)《中國藥典》2020 年版規(guī)定的3 種基原黃精化學(xué)研究顯示，基原和產(chǎn)地的差異會(huì)導(dǎo)致多糖、黃酮、皂苷類主要活性成分含量不同[11-12]，這些藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的差異會(huì)對(duì)臨床精準(zhǔn)用藥、中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及功能性產(chǎn)品開發(fā)等造成影響，因此準(zhǔn)確的基原鑒定是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量和合理應(yīng)用的根本保證。本研究收集了6 個(gè)省份3 種基原黃精共23 份，采用cpDNA非編碼區(qū)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH序列探索3種基原黃精的分子鑒定方法。3個(gè)序列的長度在800 bp 以內(nèi)，PCR 擴(kuò)增率和測序成功率為100%，表明3 個(gè)片段均有良好的引物通用性。從序列長度、變異位點(diǎn)及簡約信息位點(diǎn)綜合來看，psbA-trnH序列的變異性最大（2.4%），其次是trnL-trnF序列（1.0%），rpl20-rps12較為保守，信息位點(diǎn)數(shù)占比僅為0.4%。理想的條形碼序列需具有明顯的種間變異、足夠小的種內(nèi)變異，種間最小變異要遠(yuǎn)大于種內(nèi)最大變異[13]。本研究的3條序列中，rpl20-rps12和psbA-trnH序列種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離，種內(nèi)和種間遺傳距離之間不存在重疊區(qū)域；trnL-trnF序列最小種間距離為0.003 3 bp 與最大種內(nèi)距離0.003 8 bp 相近，遺傳距離略有重疊。采用標(biāo)準(zhǔn)的分子系統(tǒng)學(xué)方法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹是鑒定物種最常用的方法[14]，若同一個(gè)物種的不同個(gè)體在分子系統(tǒng)樹上形成單系，并且單系支持率＞50%，則認(rèn)為物種能夠被識(shí)別。采用NJ 法對(duì)23 個(gè)樣品進(jìn)行聚類，研究發(fā)現(xiàn)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH都可將3種基原黃精聚成單系，且支持率＞50%。

盡管psbA-trnH被認(rèn)為是被子植物中進(jìn)化速率最快的葉綠體間隔區(qū)之一，是藥用植物鑒定推薦的條形碼[15]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，某些物種間psbA-trnH基因間隔區(qū)存在插入缺失，長度變異較大，不利于序列比對(duì)，存在的倒位現(xiàn)象也會(huì)引起對(duì)遺傳多樣性的過度評(píng)估[16-17]。本研究中擴(kuò)增3 種黃精cpDNApsbAtrnH片段，發(fā)現(xiàn)存在一處74 bp插入缺失，這種較大的長度變異增加了序列對(duì)比難度，也使得該片段難以用于非同屬物種間的鑒定。相比之下，rpl20-rps12和trnL-trnF序列相對(duì)保守，rpl20-rps12存在3 處較小片段（1～9 bp）插入/缺失。trnL-trnF片段較短，沒有插入/缺失，但種內(nèi)和種間遺傳距離之間略有重疊。通過NJ 聚類分析判定鑒定效果，3 個(gè)片段都可將3 個(gè)種的黃精鑒別開來，但從引物通用性、序列特點(diǎn)和種內(nèi)、種間變異性綜合來看，rpl20-rps12序列更適宜。另已有研究顯示，rpl20-rps12片段可鑒別寧夏枸杞和枸杞，但未能鑒別其他枸杞屬植物[18]，因此rpl20-rps12序列是否能應(yīng)用到更多種黃精屬植物鑒別，還需更深入的分子研究。