不同產(chǎn)地野生金蕎麥SSR標(biāo)記鑒定△

趙莎，鄭司浩，李進(jìn)瞳，劉美娟，林暉才，熊啟相，曾燕，王繼永*

1.中國(guó)中藥有限公司，北京 100195；2.國(guó)藥種業(yè)有限公司，北京 100035

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara 的干燥根莖，最早記載于《本草拾遺》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版一部，具有清熱解毒、排膿祛瘀之功效，用于肺癰吐膿、肺熱喘咳、乳蛾腫痛[1]。金蕎麥根莖中主要含有原矢車(chē)菊素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、槲皮素、木犀草素等化合物[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蕎麥在抗菌消炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及增強(qiáng)免疫力等方面具有明顯的藥理活性，為金蕎麥片、復(fù)方金蕎麥顆粒、威麥寧膠囊等多種抗癌藥和癌預(yù)防藥物的主要原料，也是急支糖漿的主要原料之一，可顯著改善呼吸道炎癥[3-5]。金蕎麥分布于我國(guó)黃河以南的多個(gè)省區(qū)，主要以云南、貴州、四川3 省的野生資源最為集中，但隨著生態(tài)環(huán)境的惡化與過(guò)度采挖等因素，野生金蕎麥資源逐年減少，因此被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[6]。不同產(chǎn)地金蕎麥的總酚、鞣質(zhì)、表兒茶素含量有區(qū)別，質(zhì)量差異較大，進(jìn)行金蕎麥產(chǎn)地鑒別對(duì)于金蕎麥種質(zhì)資源鑒定具有重要意義[7-9]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性及含量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在作物遺傳多樣性、基因定位、分子輔助標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定和純度鑒定等方面都有很高的應(yīng)用價(jià)值[10-11]。詹海仙等[12]通過(guò)12對(duì)引物對(duì)不同產(chǎn)地甘草進(jìn)行區(qū)分，可用于甘草種質(zhì)資源的鑒定分析。目前，利用SSR 標(biāo)記技術(shù)分析蕎麥遺傳多樣性的研究多以甜蕎、苦蕎為研究對(duì)象[13-14]，以金蕎麥為研究對(duì)象的研究鮮有報(bào)道。本研究基于金蕎麥全基因組設(shè)計(jì)SSR 標(biāo)記引物，對(duì)來(lái)自云南、貴州、四川等地的野生金蕎麥樣本進(jìn)行遺傳多樣性及聚類(lèi)分析，篩選用于鑒別不同產(chǎn)區(qū)野生金蕎麥種質(zhì)資源的引物組合，以期為金蕎麥種質(zhì)資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)及分子標(biāo)記輔助育種等提供參考。

1 材料

野生金蕎麥樣品共35 批分別采自云南、貴州、四川地區(qū)，采集根莖活體移栽至位于云南省昆明市的中國(guó)中藥有限公司金蕎麥野生種質(zhì)資源圃，并于2020 年6 月采集當(dāng)年萌發(fā)的鮮葉，硅膠干燥保存，由國(guó)藥種業(yè)有限公司李進(jìn)瞳副主任藥師鑒定為金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara。具體樣品信息見(jiàn)表1。

表1 金蕎麥樣品信息

T100 型PCR 儀、GelDocXR+型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；1-14 型離心機(jī)（德國(guó)Sartorius 公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）。

異丙醇（批號(hào)：20190605）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：20190507）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TaqDNA 聚合酶（批號(hào)：W9205a）、10×TaqBuffer（批號(hào)：U8402a）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（批號(hào)：DC011，北京金百特生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

利用十六烷基三甲基溴化銨法（mCTAB）提取金蕎麥樣本葉片的總DNA：取野生金蕎麥樣本葉片約100 mg，浸入液氮冷凍研磨至細(xì)小粉末；加入buffer A[0.1 mol·L-1三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），pH 8.0；5 mmol·L-1乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）；0.25 mol·L-1氯化鈉（NaCl）；1%聚乙烯吡咯烷酮40（PVP-40）]1.5 mL，反復(fù)顛倒離心混勻，冰浴10 min，10 000×g離心10 min，棄上清液；在沉淀中加入buffer A 1.5 mL，反復(fù)顛倒離心混勻，冰浴10 min，10 000×g離心10 min，棄上清液。在沉淀中加入預(yù)熱的2% CTAB（0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；1.4 mol·L-1NaCl；25 mmol·L-1EDTA；2%CTAB；0.2%β-巰基乙醇；1%PVP-40）溶液800 μL，將沉淀均質(zhì)懸浮于溶液后置于65 ℃水浴鍋中保存1.5～2.0 h，期間顛倒均質(zhì)溶液3～5 次。將混合液放至室溫，10 000×g離心5 min，取上清液，加入等體積CI 溶液（三氯甲烷-異戊醇24∶1），在顛倒搖床上混合10 min，10 000×g離心5 min，取上清液，加入等體積CI 溶液，在顛倒搖床上混合10 min?；旌弦?0 000×g離心5 min，取上清液至1.5 mL 離心管中，加入0.6 倍體積冷的異丙醇，顛倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1 h以上，10 000×g離心2 min，棄上清液，得到凝固體。將離心管倒置于干燥紙上盡量控干液滴，加入RNase 溶液（100 mg·L-1）100 μL，37 ℃保存0.5 h，依次加入雙蒸水（ddH2O）150 μL，5 mol·L-1NaCl 50 μL 和無(wú)水乙醇700 μL，充分混合后10 000×g離心2 min，棄上清液，將離心管倒置于干燥紙上盡量控干液滴，加入70%乙醇600 μL，混合后10 000×g離心2 min，棄上清液。再次加入70%乙醇600 μL，混合后10 000×g離心2 min，棄上清液，干燥除去乙醇，加TE緩沖液100 μL溶解，得到DNA溶解液。

將金蕎麥葉片的總DNA 進(jìn)行純化，用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行操作，得到純化的DNA 溶解液，應(yīng)用NanoDrop One 型超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，稀釋至50 ng·μL-1，待后續(xù)PCR擴(kuò)增使用。

2.2 SSR引物設(shè)計(jì)

從本課題組破譯的金蕎麥全基因組高通量數(shù)據(jù)中篩選出6935 對(duì)SSR 引物。在SSR 核心區(qū)側(cè)翼序列中（150 bp 范圍），使用primer 3 進(jìn)行primer 引物設(shè)計(jì)，引物最佳長(zhǎng)度為24 bp；引物最小長(zhǎng)度為20 bp；引物最大長(zhǎng)度為28 bp；最佳退火溫度為63 ℃；最低退火溫度為60 ℃；最高退火溫度為65 ℃；1對(duì)引物退火溫度的最大差值為1 ℃。其他參數(shù)采用primer 3 的默認(rèn)參數(shù)。將引物BLAST 比對(duì)回基因組上，將成對(duì)引物在基因組上可以擴(kuò)增得到的序列長(zhǎng)度進(jìn)行比較，與含有目標(biāo)SSR 的產(chǎn)物長(zhǎng)度差在2 kb以上，保留該對(duì)引物，與含SSR 產(chǎn)物長(zhǎng)度差在2 kb以下則濾掉該引物，最終即可得到SSR 候選引物。篩選出來(lái)的SSR 候選引物中，選擇重復(fù)單元（堿基序列）堿基數(shù)2～5 bp、重復(fù)單元（堿基序列）重復(fù)5～10 次的引物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。所選擇的引物長(zhǎng)度為20～25 bp，理論退火溫度在55 ℃左右，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為150～350 bp。

2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

用篩選出的引物對(duì)金蕎麥DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：10×TaqBuffer 2 μL，2 mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）2 μL，5 μmol·L-1引物對(duì)各1 μL，1.0 UTaqDNA 聚合酶0.2 μL，50 ng·μL-1DNA 模板2 μL，加滅菌雙蒸水至20 μL。設(shè)置未加模板DNA 的PCR 反應(yīng)為陰性對(duì)照。反應(yīng)程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；退火30 s（JQM03、JQM04 退火溫度為56 ℃，JQM07、JQM21 退火溫度為58 ℃，JQM19 退火溫度為54 ℃）；72 ℃，1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有條帶、片段大小是否合適，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)是否成功。將檢驗(yàn)成功的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)分型，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分型結(jié)果。

2.4 數(shù)據(jù)分析

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分型結(jié)果用GeneMarker 4.0進(jìn)行峰圖判讀，以“0，1”二元方式來(lái)記錄等位基因片段大小，即某一等位基因存在時(shí)記為1，某一等位基因不存在時(shí)記0，缺失數(shù)據(jù)記為-9，從而得到等位基因矩陣，并通過(guò)GenALEx 計(jì)算金蕎麥在每個(gè)產(chǎn)地、個(gè)體間的遺傳多樣性數(shù)據(jù)?；贕enALEx計(jì)算所得的個(gè)體遺傳距離矩陣，通過(guò)MEGA 進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選

利用不同產(chǎn)地的金蕎麥樣本對(duì)設(shè)計(jì)的SSR 引物開(kāi)展預(yù)試驗(yàn)，從擴(kuò)增成功率及多態(tài)性（毛細(xì)管熒光電泳方式）2個(gè)維度進(jìn)行引物的篩選，最終選定5對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增成功率高的SSR 分子標(biāo)記引物，引物信息見(jiàn)表2。JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 這5 對(duì)引物對(duì)四川產(chǎn)地的金蕎麥擴(kuò)增成功率高，JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 這4 對(duì)引物對(duì)貴州產(chǎn)地的金蕎麥擴(kuò)增成功率高。

表2 金蕎麥產(chǎn)地鑒別SSR引物篩選

3.2 不同產(chǎn)區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析

3.2.1 四川地區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21得到各居群的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表3，結(jié)果顯示，3個(gè)居群觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為2.400～8.200，有效等位基因數(shù)（Ne）為2.236～5.727，Shannon′s指數(shù)（I）為0.739～1.768，其中四川居群的等位基因均值最低，相應(yīng)的I也較低。云南居群、貴州居群的觀測(cè)雜合度（Ho）≈期望雜合度（He），表明該居群比較符合客觀狀態(tài)；四川居群Ho＞He，表明該居群可能存在一定的雜種選擇現(xiàn)象或者遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

表3 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地野生金蕎麥遺傳多樣性分析

3.2.2 貴州地區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21得到各居群的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表4，結(jié)果顯示，3 個(gè)居群Na為4.750～6.750，Ne為2.650～3.590，I為1.189～1.499，其中貴州居群的等位基因均值最低，相應(yīng)的I也較低。云南、四川居群Ho＜He，表明該居群可能存在一定的近交現(xiàn)象或者有雜合缺失未檢測(cè)到的情況；貴州居群Ho＞He，表明該居群可能存在一定的雜種選擇現(xiàn)象或者遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

表4 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地野生金蕎麥遺傳多樣性分析

3.3 聚類(lèi)結(jié)果分析

3.3.1 四川地區(qū)金蕎麥鑒定 基于金蕎麥SSR引物組 合QM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21，通過(guò)GenALEx計(jì)算各居群間遺傳相似性系數(shù)（表5）。由表5 可知，3 個(gè)居群間平均遺傳相似性系數(shù)為0.472，其中云南居群與貴州居群的遺傳相似性系數(shù)最大為0.769，說(shuō)明云南、貴州居群的種群關(guān)系近，四川與云南、貴州居群的遺傳相似性系數(shù)分別為0.333、0.313，說(shuō)明四川與云南、貴州居群種群關(guān)系相對(duì)更遠(yuǎn)?；贕enALEx 計(jì)算所得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，通過(guò)MEGA 進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)（圖1）可知，只有四川居群的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時(shí)也說(shuō)明基于金蕎麥SSR 引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以較好地對(duì)產(chǎn)地為四川產(chǎn)地的金蕎麥進(jìn)行區(qū)分鑒定。

表5 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的各居群間遺傳相似性系數(shù)

圖1 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地金蕎麥樣品的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

3.3.2 貴州地區(qū)金蕎麥鑒定 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21，通 過(guò)GenALEx 計(jì)算各居群間遺傳相似性系數(shù)（表6）。通過(guò)表6 可知，居群間平均遺傳相似系數(shù)為0.455，其中云南與貴州居群的遺傳相似系數(shù)最大為0.644，說(shuō)明云南、貴州居群的種群關(guān)系近；四川與云南、貴州居群的遺傳相似系數(shù)分別為0.413、0.308，說(shuō)明四川與云南、貴州兩居群種群關(guān)系相對(duì)更遠(yuǎn)?；贕enALEx 計(jì)算所得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，通過(guò)MEGA 進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)（圖2）可知，只有貴州居群的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時(shí)也說(shuō)明基于金蕎麥SSR引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21可以較好地對(duì)產(chǎn)地為貴州產(chǎn)地的金蕎麥進(jìn)行區(qū)分鑒定。

圖2 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地金蕎麥樣品的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

表6 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的各居群間遺傳相似性系數(shù)

4 討論

我國(guó)西南地區(qū)是國(guó)際公認(rèn)的蕎麥起源中心，也是遺傳多樣性中心[15]。張春平等[16]采用隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)對(duì)重慶市7 個(gè)野生金蕎麥居群的87 個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出金蕎麥種內(nèi)有豐富的遺傳多樣性，且與地理因素有顯著相關(guān)性。鄧蓉等[17]應(yīng)用簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)（ISSR）標(biāo)記方法，對(duì)貴州省內(nèi)11 個(gè)不同地域的金蕎麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析，得出種質(zhì)間遺傳差異較小且相對(duì)穩(wěn)定，為金蕎麥品種ISSR 指紋圖譜建立、種質(zhì)資源鑒定、基因定位等工作提供科學(xué)依據(jù)。程成等[6]使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、matK分子標(biāo)記手段，對(duì)收集的云南省內(nèi)金蕎麥進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明海拔是影響其分類(lèi)的主要因素。

本研究首次基于金蕎麥全基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記引物，對(duì)來(lái)自云南、貴州、四川3 個(gè)不同產(chǎn)地金蕎麥樣本進(jìn)行遺傳多樣性及聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的金蕎麥具有豐富的遺傳多樣性，云南、貴州居群的種群關(guān)系近，四川與云南、貴州兩居群種群關(guān)系相對(duì)更遠(yuǎn)。引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以對(duì)產(chǎn)地為四川的金蕎麥進(jìn)行鑒定區(qū)分；引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以對(duì)產(chǎn)地為貴州的金蕎麥進(jìn)行鑒定區(qū)分；引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可成功對(duì)云南產(chǎn)地金蕎麥進(jìn)行擴(kuò)增，但可能由于云南產(chǎn)地的金蕎麥混雜較為嚴(yán)重，目前無(wú)法從產(chǎn)地將其區(qū)分開(kāi)。后續(xù)研究將繼續(xù)加大樣本量，驗(yàn)證并篩選更多、更穩(wěn)定的SSR 標(biāo)記引物，為金蕎麥種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)，遺傳多樣性分析和金蕎麥新品種選育提供更多的參考依據(jù)。