血清微小RNA-150表達水平與晚期非小細(xì)胞肺癌患者行表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療效果及預(yù)后的關(guān)系▲

關(guān) 英 郭麗云 王千千 阿選德

(1 青海省西寧市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西寧市 810000，電子郵箱：gy55255@163.com；甘肅省腫瘤醫(yī)院2 放療科，3 腫瘤內(nèi)科，蘭州市 730000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有類型肺癌的85%以上，其起病隱匿，早期無明顯癥狀，故患者確診時多為臨床晚期，錯失手術(shù)治療時機[1]。近年來，分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)被廣泛應(yīng)用于晚期NSCLC患者的治療中，其可有效地改善患者生活質(zhì)量，延長患者生存時間[2]。目前，臨床上多通過復(fù)查MRI或CT評估NSCLC患者的治療效果，同時一些常見的血清腫瘤標(biāo)志物也可作為評估NSCLC患者療效的輔助指標(biāo)[3-4]。研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA)-150在NSCLC患者血清中呈高表達，其可能通過靶向結(jié)合SRC激酶信號抑制劑1基因從而促進NSCLC細(xì)胞的增殖及遷移，被認(rèn)為是診治NSCLC的潛在靶標(biāo)[5]。但血清miRNA-150水平與晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治療的效果、預(yù)后之間關(guān)系的相關(guān)研究鮮少?；诖?，本研究探討血清miRNA-150水平與NSCLC患者行EGFR-TKI治療效果及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2017年12月西寧市第一人民醫(yī)院收治的172例晚期NSCLC患者為研究對象。其中男性82例、女性90例，患者年齡46～85(66.54±10.39)歲；有吸煙史者102例，無吸煙史者70例；腺癌134例，非腺癌38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均經(jīng)細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)病理學(xué)明確診斷；(2)均為原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠處轉(zhuǎn)移分期Ⅲ～Ⅳ期；(3)均對本研究所用藥物無禁忌證；(4)臨床檢查資料完整；(5)患者及其家屬均對本研究知情同意，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心血管系統(tǒng)疾病者；(2)合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能障礙者；(3)失訪者；(4)病理診斷不明確者。本研究符合倫理學(xué)有關(guān)規(guī)定，獲得西寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核、批準(zhǔn)后實施。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol Reagent(批號：J44580)購買于上海金穗生物科技有限公司，TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit(批號：4366597)購買于上海北諾生物科技有限公司，TaqMan? MicroRNA Assay(批號：MTTXXXXX-ZTD)購買于北京百奧萊博科技有限公司。超微量分光光度計(型號：OSE-260)購買于天根生化科技(北京)有限公司，實時熒光定量PCR儀(型號：4351104)購買于北京智杰方遠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 治療及隨訪方法：NSCLC患者均口服EGFR-TKI吉非替尼(英國阿斯利康公司，國藥準(zhǔn)字J20100014)1片/d(2周為1個療程)，直到難以耐受或腫瘤進展[7]，同時給予常規(guī)局部放療。具體放療方案：選取6MV-X線，4野照射進行放療，5次/周照射，2～3 Gy/次，共四周?；颊呙吭逻M行頭部、胸部CT、MRI-腹部B超和全身骨SPECT/CT掃描檢查，評估轉(zhuǎn)移灶范圍及大小。對172例NSCLC患者進行長期隨訪，隨訪時間從接受EGFR-TKI治療開始，截至2019年12月30日，或至患者死亡。

1.3.2 療效評價：2個療程結(jié)束后評價NSCLC患者服用吉非替尼的療效，以頭部、胸部CT、MRI、胸腹部B超掃描和全身骨SPECT/CT掃描為依據(jù)，按照RECIST 1.1版實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[7]進行療效判定。其中，完全緩解指治療后所有腫瘤病灶均消失，并維持1個月以上；部分緩解指治療后腫瘤病灶最大直徑總和較前縮小>30%，并維持1個月以上；疾病穩(wěn)定指治療后腫瘤病灶直徑略有縮小，但未達部分緩解水準(zhǔn)，或腫瘤病灶最大直徑有所增加，但未超過20%；疾病進展指治療后腫瘤病灶最大直徑總和較前增加超過20%，或出現(xiàn)新病灶。治療總有效率=(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。根據(jù)治療效果將NSCLC患者分為有效組、無效組，將完全緩解、部分緩解患者納入有效組，將疾病穩(wěn)定、疾病進展患者納入無效組。

1.3.3 血清樣本采集：在治療前和接受2個療程后，收集所有患者清晨空腹肘靜脈血3～4 mL，靜置25～30 min，3 800 r/min離心8 min，獲得血清，分裝密封保存于-80℃冰箱中備用待檢。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測血清miRNA-150相對表達水平：解凍凍存血清樣本，利用TRIzol Reagent試劑提取樣本總RNA。參照TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書將DNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以適量cDNA為模板，參考TaqMan? MicroRNA Assay說明書配制反應(yīng)體系，進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA 2 μL，2×Taqman? Universal Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無核酸酶水6 μL，總體積為20 μL。以U6為內(nèi)參基因。miRNA-150上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6上游引物序列為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列為5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以2-ΔΔCt法計算miRNA-150相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier曲線法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗分析生存曲線間的差異；采用Cox回歸模型分析NSCLC患者預(yù)后的影響因素。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR-TKI治療效果及不同療效NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平的比較 經(jīng)EGFR-TKI治療后，172例NSCLC患者血清中治療有效46例，治療無效126例，有效率為26.74%(46/172)。治療前，172例NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平為(1.76±0.67)，有效組、無效組患者血清miRNA-150相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，有效組血清miRNA-150相對表達水平低于治療前和無效組(均P<0.05)，無效組血清miRNA-150相對表達水平高于治療前(P<0.05)。見表1。

表1 不同療效NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平的比較(x±s)

2.2 不同臨床特征NSCLC患者的EGFR-TKI療效比較 與有吸煙史者相比，無吸煙史的NSCLC患者的EGFR-TKI治療有效率更高(P<0.05)；治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的NSCLC患者治療有效率更高(P<0.05)；NSCLC患者的年齡、性別、組織學(xué)類型與EGFR-TKI治療效果無關(guān)(均P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征NSCLC患者的EGFR-TKI療效比較[n(%)]

2.3 治療前血清miRNA-150相對表達水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 對172例NSCLC患者進行隨訪0～24個月，死亡117例，存活率為31.98%(55/172)。Kaplan-Meier生存分析顯示，治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76者的平均生存期為21.02個月，miRNA-150相對表達水平≥1.76者的平均生存期為16.75個月，miRNA-150相對表達水平<1.76者的累積生存率高于miRNA-150相對表達水平≥1.76者(χ2=34.707，P<0.001)見圖1。

2.4 NSCLC患者行EGFR-TKI治療后生存情況的影響因素 以NSCLC患者年齡(<65歲=0，≥65歲=1)、性別(女=0，男=1)、吸煙史(無=0，有=1)、組織學(xué)類型(腺癌=0，非腺癌=1)、治療前血清miRNA-150相對表達水平(<1.76=0，≥1.76=1)為自變量，以NSCLC患者預(yù)后為因變量(生存=0，死亡=1)，進行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，組織學(xué)類型、血清miRNA-150相對表達水平是NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情況的獨立影響因素(均P<0.05)。見表3。

圖1 治療前血清miRNA-150相對表達水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

表3 NSCLC患者行EGFR-TKI治療后生存情況影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

NSCLC是最常見的肺癌類型，其發(fā)病率及病死率極高，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[8]?；熓侵委熗砥贜SCLC患者的主要手段，但化療效果欠佳及藥物的毒副作用限制其臨床應(yīng)用范圍。研究顯示，EGFR-TKI靶向治療已成為治療表皮生長因子受體基因敏感突變的晚期NSCLC患者的首選方案[9]。本研究結(jié)果顯示，EGFR-TKI治療NSCLC患者的有效率為26.74%，與高原等[10]的研究結(jié)果相似，提示EGFR-TKI治療晚期NSCLC具有一定臨床療效。

臨床上多采用影像學(xué)手段評價NSCLC患者的治療效果，但影像學(xué)檢查費用昂貴，具有輻射副作用，不適合短時間重復(fù)檢查，存在一定局限性。而血清標(biāo)志物對惡性腫瘤的治療效果有一定評估價值，且血清學(xué)指標(biāo)具有取樣方便、檢測快速、重復(fù)性好等特點。miRNA廣泛分布于外周血及各器官組織中，其可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，在直腸癌、肝癌、胰腺癌、NSCLC等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[11-13]。研究顯示，miRNA-150-5p是miRNA-150家族成員之一，其在NSCLC中表達失調(diào)，可通過靶向調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白A2等的表達水平，影響NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[14]。另有研究顯示，miRNA-150在NSCLC中表達上調(diào)，其可通過靶向負(fù)調(diào)控叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4，進而影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移，此外，而敲除叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4表現(xiàn)出和miRNA-150過表達類似的分子效應(yīng)，由此可見miRNA-150可能通過調(diào)控相關(guān)信號通路，在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起到促進作用[15]。徐建林等[16]發(fā)現(xiàn)，miRNA-150在NSCLC患者腫瘤組織中過表達，miRNA-150高水平者預(yù)后較差，認(rèn)為其有望成為診斷NSCLC及預(yù)后監(jiān)測的分子標(biāo)志物。以上研究表明，異常表達的miRNA-150與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展進程關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，EGFR-TKI治療后，有效組血清miRNA-150相對表達水平低于治療前和無效組(P<0.05)，無效組血清miRNA-150相對表達水平高于治療前(P<0.05)，提示miRNA-150可能在NSCLC的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且治療前血清miRNA-150水平與晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療效果有關(guān)。推測可能原因為miRNA-150作為miRNA家族一員，其可能通過與靶基因結(jié)合影響信號傳導(dǎo)，進而影響NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲等生物學(xué)過程，從而影響NSCLC的發(fā)展進程；如吉非替尼等EGFR-TKI可通過與三磷酸腺苷競爭酪氨酸激酶位點，進而抑制胞內(nèi)酪氨酸激酶的磷酸化，抑制表皮生長因子受體信號傳導(dǎo)，抑制癌細(xì)胞增殖、生長及血管生成等，從而在進展性及復(fù)發(fā)性NSCLC中發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。由此，miRNA-150可能是吉非替尼等EGFR-TKI的作用靶點，NSCLC患者經(jīng)EGFR-TKI治療后，miRNA-150水平發(fā)生變化，提示miRNA-150水平變化能反映EGFR-TKI的治療效果。此外，經(jīng)EGFR-TKI治療后，有效組NSCLC患者病灶顯著縮小，惡性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移受抑制，血清miRNA-150相對表達水平可能受影響。

本研究結(jié)果顯示，無吸煙史、治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的患者行吉非替尼治療的效果更好。治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的NSCLC患者經(jīng)吉非替尼治療后的生存率高于治療前血清miRNA-150相對表達量≥1.76的患者(P<0.05)；進一步行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)組織學(xué)類型、治療前血清miRNA-150相對表達水平是影響NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情況的獨立影響因素(P<0.05)。這提示治療前血清miRNA-150表達水平異常均可能會影響NSCLC患者行EGFR-TKI治療后的預(yù)后情況，動態(tài)監(jiān)測血清miRNA-150水平，有利于評估患者預(yù)后狀況。

綜上所述，治療前血清miRNA-150表達水平低與晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治療的效果及預(yù)后較好密切相關(guān)，監(jiān)測血清miRNA-150水平或有助于評估NSCLC患者預(yù)后。但本研究樣本量較少，實驗結(jié)果可能出現(xiàn)偏差，后續(xù)將增加樣本量進行深入探究。