血小板反應(yīng)蛋白-1在PCOS患者中對(duì)卵巢血流調(diào)控作用及其對(duì)人卵巢微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

王宇欣，張婷，公丕東，田婷婷，劉寧，劉羽，王超，劉梅梅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，哈爾濱 150086)

多囊卵巢綜合征(PCOS)多見(jiàn)于青春期和生育年齡女性中，是下丘腦-垂體-卵巢軸激素失調(diào)的最常見(jiàn)疾病，無(wú)論是近期的臨床表現(xiàn)，還是遠(yuǎn)期并發(fā)癥，都影響著女性的生理和心理健康。

血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)是第一個(gè)被鑒定的天然血管生成抑制劑，作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，參與多種病理生理過(guò)程[1]。TSP-1具有多種功能，其特定結(jié)構(gòu)域可匹配各種細(xì)胞表面受體，發(fā)揮多種生物學(xué)活性作用。TSP-1可阻斷大多數(shù)正調(diào)節(jié)血管生成的功能蛋白，并抑制依賴于生長(zhǎng)因子的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的增殖、遷移和形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，患有PCOS的女性的超聲下卵巢血流量顯著高于健康對(duì)照組，卵巢基質(zhì)動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(PI)、阻力指數(shù)(RI)均低于對(duì)照組，且與高雄激素血癥顯著相關(guān)[3]。我們前期研究已證明，PCOS 女性卵泡期卵巢間質(zhì)血供較健康女性明顯增多[4]。Tahergorabi等[5]發(fā)現(xiàn)PCOS女性血清TSP-1表達(dá)量較健康女性顯著降低。但是關(guān)于PCOS患者血清的TSP-1表達(dá)與卵巢間質(zhì)血流的相關(guān)性研究較少，而TSP-1是否通過(guò)影響人卵巢微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HOMEC)的增殖而調(diào)控血管系統(tǒng)等，均尚不清楚。本研究擬探討PCOS患者血清中TSP-1的差異表達(dá)及其與卵巢血流的相關(guān)性分析，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步研究TSP-1對(duì)HOMEC細(xì)胞增殖的作用。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2018年10月至2019年10月于我院就診的診斷為PCOS的女性共50例納入PCOS組，將同期因男性因素就診的非PCOS不孕女性50例納入對(duì)照組。

根據(jù)2003年的鹿特丹會(huì)議，PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]包括：(1)雄激素異常升高的臨床表現(xiàn)或性激素檢查中雄激素升高；(2)排卵頻率降低或無(wú)排卵；(3)卵巢多囊形態(tài)，即單或兩側(cè)卵巢中存在數(shù)目增多(≥12個(gè))、特定直徑范圍(2～9 mm)的卵泡，或卵巢體積增大(>10 cm3)。具備以上2項(xiàng)或以上，同時(shí)排除其他導(dǎo)致雄激素異常升高的疾病。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：生育年齡的健康女性，月經(jīng)頻率正常，無(wú)高雄激素臨床表現(xiàn)；內(nèi)分泌激素水平正常，超聲顯示子宮、雙側(cè)卵巢均無(wú)異常形態(tài)改變，超聲顯示無(wú)其他盆腔病變。

所有參與者需排除：妊娠、高泌乳素血癥、甲狀腺和腎上腺疾病、全身性疾病如高血壓和糖尿病等；近期(6個(gè)月內(nèi))應(yīng)用激素藥物。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者已簽署知情同意書(shū)，在本院生殖中心開(kāi)展。

二、主要試劑

HOMEC和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)(上海中喬新舟)；0.25%胰酶消化液(上海碧云天)；TSP-1(Origen，美國(guó))；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8，大連美侖生物)；人TSP-1 ELISA試劑盒(Thermo Fisher，芬蘭)。

三、研究方法

1.性激素測(cè)定：于卵泡早期(月經(jīng)周期第2～4天)，空腹12 h或以上，上午8～10時(shí)，抽取外周靜脈血進(jìn)行性激素檢查；若閉經(jīng)2個(gè)月以上的參與者，超聲顯示無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡，也可進(jìn)行性激素檢查。性激素項(xiàng)目包括卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和睪酮(T)。所有檢測(cè)均采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定。余下血清置于-20 ℃冰箱中備用。本研究中T>1.67 nmol/L界定為高雄激素血癥。

2.血清TSP-1水平檢測(cè)：采用ELISA法，按試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)上述備用血清中TSP-1表達(dá)水平。

3.卵巢間質(zhì)血流的測(cè)定：于采血當(dāng)日上午8～10時(shí)，使用陰道彩色多普勒超聲儀對(duì)所有受試者完成下述檢查：同一操作者，在未知參與者激素水平的情況下，測(cè)量參與者的左、右卵巢間質(zhì)血流，計(jì)算并記錄卵巢PI和RI。重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

4.體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)HOMEC，使用完全ECM培養(yǎng)基，條件為37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱，24～36 h換液。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%后，吸取適量37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶完成消化操作，傳代培養(yǎng)。為保證細(xì)胞活力，取第3～5代HOMEC進(jìn)行后續(xù)操作。

5.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：以5×103個(gè)/孔將HOMEC接種到96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)孔分別加入含有濃度為10-11mmol/L、10-10mmol/L、10-9mmol/L TSP-1的完全ECM，對(duì)照孔加入等量完全ECM，空白孔內(nèi)不含細(xì)胞并加入等量完全ECM。常規(guī)條件培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，每孔注入CCK-8增強(qiáng)型溶液10 μl。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5～1 h，測(cè)定450 nm吸光度(OD值)。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。計(jì)算公式：抑制率=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者性激素、TSP-1水平及卵巢間質(zhì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

PCOS組的FSH、E2水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)，而PCOS組的LH、T及LH/FSH均顯著高于對(duì)照組(P<0. 05)。與對(duì)照組相比，PCOS組TSP-1水平顯著降低(P<0.05)，卵巢間質(zhì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI值均顯著降低(P<0.05)(表 1、圖1)。

表1 兩組患者性激素、TSP-1水平及卵巢血流參數(shù)比較(-±s)

圖1 陰道超聲檢測(cè)卵巢間質(zhì)血流圖

二、PCOS組卵巢間質(zhì)血流參數(shù)RI、PI值與TSP-1的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，TSP-1與RI呈顯著正相關(guān)(r=0.83，P<0.05)(圖2A)，TSP-1與PI亦呈顯著正相關(guān)(r=0.85，P<0.05)(圖2B)。

三、TSP-1對(duì)HOMEC活力的影響

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10-11mmol/L TSP-1組、10-10mmol/L TSP-1組，10-9mmol/L TSP-1組作用12 h、24 h、48 h后，細(xì)胞抑制率均顯著升高(P均<0.05)(表2)，提示TSP-1抑制HOMEC增殖。在TSP-1作用12 h、24 h、48 h，TSP-1對(duì)HOMEC的抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)(P<0.05)；在不同濃度TSP-1組(10-11mmol/L、10-10mmol/L、10-9mmol/L)中，與TSP-1作用12 h相比，TSP-1作用24 h、48 h的細(xì)胞抑制率均顯著升高(P<0.05)(表2，圖3)，在24 h時(shí)達(dá)到峰值。

圖2 PCOS組卵巢間質(zhì)血流參數(shù)RI、PI值與TSP-1的相關(guān)性分析

表2 各濃度TSP-1作用不同時(shí)間對(duì)HOMEC活力的抑制效果(-±s)

與同時(shí)間點(diǎn)10-11 mmol/L組比較，*P<0.05。圖3 不同濃度TSP-1作用不同時(shí)間對(duì)HOMEC的抑制率

討 論

PCOS是下丘腦-垂體-卵巢軸激素失調(diào)的最常見(jiàn)疾病，以排卵障礙，超聲影像提示卵巢多囊形態(tài)，臨床表現(xiàn)雄激素異常升高為特征，通常伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂升高和不孕，遠(yuǎn)期可并發(fā)心血管疾病和代謝綜合征等，其病因尚不清楚[7]。卵巢毛細(xì)血管網(wǎng)支持卵泡發(fā)育和黃體形成，卵巢血供具波動(dòng)性，該波動(dòng)情況與卵泡生長(zhǎng)情況、內(nèi)分泌水平相一致。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者超聲下顯示卵巢間質(zhì)血流增多、頻譜為高速低阻[4]；測(cè)量卵巢間質(zhì)動(dòng)脈參數(shù)，發(fā)現(xiàn)PCOS患者RI、PI值的顯著降低，即卵巢間質(zhì)血流較正常女性顯著增多[8]。

TSP-1是首先被鑒定的體內(nèi)來(lái)源的負(fù)性調(diào)節(jié)血管生成的蛋白[1]。TSP-1可以拮抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的活性來(lái)減少血管生成，結(jié)合CD36、CD47和整合素發(fā)揮功能[9]。在過(guò)表達(dá)TSP-1的裸鼠異種移植瘤中，微血管密度降低[10]。在微血管ECs中，TSP-1與CD36的Clesh結(jié)構(gòu)域匹配，進(jìn)而激活下游的Src家族通路，誘導(dǎo)ECs凋亡[11]。

Tahergorabi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的血清TSP-1水平較健康對(duì)照者顯著下降，且隨著PCOS婦女的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的增高而呈進(jìn)一步下降趨勢(shì)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，PCOS大鼠的卵巢體積和質(zhì)量明顯增大，卵巢中的TSP-1蛋白含量下降[12]。本研究結(jié)果顯示，在PCOS患者中，血清TSP-1含量下降，且超聲顯示卵巢動(dòng)脈RI、PI降低。RI、PI是反映卵巢動(dòng)脈血流阻力的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其指標(biāo)降低表明卵巢血流的灌注更加豐富。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)TSP-1表達(dá)水平與RI、PI具有正相關(guān)性，提示PCOS患者卵巢血流量的改變與TSP-1的表達(dá)可能具有一定的相關(guān)性。

以往關(guān)于TSP-1對(duì)血管系統(tǒng)的研究均集中在腫瘤血管[13]、皮膚傷口愈合過(guò)程中的血管生成、成纖維細(xì)胞[14]等，對(duì)卵巢微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HOMEC)的研究報(bào)道卻很缺乏。血管ECs種類(lèi)繁多，性質(zhì)復(fù)雜，對(duì)不同刺激的反應(yīng)性不同，如人臍靜脈ECs和人主動(dòng)脈ECs對(duì)TSP-1的不同反應(yīng)，TSP-1抑制人主動(dòng)脈ECs中VEGF的表達(dá)水平，卻不能抑制人臍靜脈ECs中VEGF的表達(dá)水平[15]。在PCOS患者中TSP-1影響卵巢血流的具體機(jī)制尚不明確。因此，我們通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)研究TSP-1對(duì)HOMEC增殖的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSP-1可顯著抑制HOMEC的細(xì)胞增殖活力，且細(xì)胞抑制率隨著TSP-1濃度的增加而增加，在10-9mmol/L～10-11mmol/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性抑制；而在同一藥物濃度下，隨著時(shí)間的增加，TSP-1對(duì)HOMEC的抑制率先增加，在作用24 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降，但在作用48 h時(shí)仍高于12 h時(shí)。TSP-1對(duì)于HOMEC增殖活力的抑制作用在12～24 h內(nèi)有著時(shí)間依賴性，24 h之后的抑制作用下降可能與細(xì)胞代謝TSP-1有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者血清中TSP-1表達(dá)降低，超聲顯示卵巢間質(zhì)血流量豐富，卵巢間質(zhì)血流參數(shù)RI、PI值顯著降低，且TSP-1表達(dá)水平與RI、PI值呈現(xiàn)正相關(guān)；此外，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSP-1可以抑制HOMEC的增殖。提示PCOS患者卵巢間質(zhì)血流增多可能來(lái)自于抑制HOMEC增殖的TSP-1的低表達(dá)。本研究從血管生成方面初步探究了TSP-1對(duì)HOMEC的作用；不足之處在于本實(shí)驗(yàn)中選取的HOMEC為健康細(xì)胞系，而不是從PCOS模型中分離提取、原代培養(yǎng)的細(xì)胞。在進(jìn)一步的研究中我們擬從PCOS大鼠卵巢中提取原代HOMEC做更深入的研究。此外，TSP-1在PCOS中抑制HOMEC增殖的具體分子調(diào)控機(jī)制需要我們進(jìn)一步研究。