一株氨化芽孢細(xì)菌的分離鑒定及氨化培養(yǎng)基優(yōu)化

朱欣樂(lè)， 陳思宇， 楊正， 劉晶， 黃元昊， 彭英杰， 蘭時(shí)樂(lè)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

人類需要從食物中攝取蛋白質(zhì)以維持正常的生命活動(dòng)。水產(chǎn)品、谷類和牛奶是食物蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，其中水產(chǎn)品約占蛋白質(zhì)總供應(yīng)量的6.5%[1]。隨著消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品需求量的增加，促使了水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖模式的快速發(fā)展，同時(shí)也導(dǎo)致了養(yǎng)殖水體日益嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，而氮是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵元素[2]。養(yǎng)殖水體中的氮污染物主要包括有機(jī)氮化物以及NH4+-N、NO2--N、NO3--N等無(wú)機(jī)氮。目前，國(guó)內(nèi)外許多科研工作者對(duì)水體中無(wú)機(jī)氮的去除進(jìn)行了大量卓有成效的研究[3-6]，但有機(jī)氮的氨化過(guò)程研究較少。氨化作用是水體中有機(jī)氮去除的起始環(huán)節(jié)，直接影響到后續(xù)除氮進(jìn)程[7]。氨化細(xì)菌將有機(jī)氮降解為NH4+-N，再通過(guò)硝化作用和反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2O、N2[8-9]，以此實(shí)現(xiàn)水體脫氮。

目前已報(bào)道的氨化細(xì)菌主要包括Bacillus[10]、Pseudomonas[2,11]、Micrococcus[12]、Arthrobactersp.[2]、Lysinibacillusfusiformis[13]、Stenotrophomonasmaltophilia[14]、Enterobacteraerogenes[15]等。本試驗(yàn)從精養(yǎng)池塘底泥中分離純化得到10株具有氨化能力的芽孢桿菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析的方法鑒定菌株ZXL-7，初步探討培養(yǎng)基組成對(duì)菌株ZXL-7氨化能力的影響，為氨化細(xì)菌用于養(yǎng)殖水體中有機(jī)氮降解提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離樣品來(lái)源

菌種分離樣品采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地精養(yǎng)池塘底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：魚粉1%，葡萄糖2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，pH 7.2。

平板分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

種子液培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，蛋白胨1%，pH 7.2。

斜面培養(yǎng)基：在種子液培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

分離培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，NaCl 0.025%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2。

氨化培養(yǎng)基[16]：葡萄糖3%，豆粕粉1.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，MnSO4·H2O 0.05%，NaCl 0.3%，pH 7.2。

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]配制生理生化鑒定培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩

稱取10 g底泥樣品接種至100 mL加有玻璃珠的富集培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)4 d，吸取10 mL富集液于90 mL無(wú)菌水中，置于80 ℃水浴鍋中處理15 min。按照10倍稀釋法逐級(jí)稀釋，取0.1 mL梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液分別涂于分離培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)至菌落生長(zhǎng)。挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行多次劃線分離。選擇純化的菌落轉(zhuǎn)接于斜面保存。

1.2.2 菌種復(fù)篩

將分離得到的菌株接種到種子液培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。按5%(V/V)接種量把菌液分別接種到氨化培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定培養(yǎng)液中NH4+-N含量。3次重復(fù)。

1.2.3 菌種鑒定

(1)形態(tài)學(xué)觀察。將菌株ZXL-7接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色。

(2)生理生化試驗(yàn)。按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行試驗(yàn)。

(3)16S rDNA序列分析。通過(guò)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總基因組DNA，以通用引物27F(AGTTTGATCMTGGCTC)、1492R(GGTTACCTTGTTACGA)擴(kuò)增16S rDNA。表1、2為PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件。PCR純化產(chǎn)物由上海生物工程股份有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST程序與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用軟件Mega7.0(neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中Boot-strap分析重復(fù)設(shè)置為1 000。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 1 PCR amplification reaction system

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Table 2 PCR amplification reaction conditions

1.2.4 氨化培養(yǎng)基研究

改變氨化培養(yǎng)基中碳源種類(酒石酸鉀鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉)、碳源添加量(20、25、30、35、40 g/L)、氮源種類(豆粕粉、酵母粉、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨)、KH2PO4添加量(1、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L)、MgSO4·7H2O添加量(0.5、1、1.5、2.0、2.5 g/L)、MnSO4·H2O添加量(0、0.25、0.5、0.75、1 g/L)等研究各因素對(duì)菌株氨化效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇對(duì)氨化效果有顯著影響的丁二酸鈉(A)、KH2PO4(B)、MgSO4·7H2O(C)、MnSO4·H2O(D)為4個(gè)因素，以氨氮增加量(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素與水平如表3所示。

表3 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 3 Level and factors design of response surface

1.3 氨氮含量測(cè)定

將培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，以未接種的氨化培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，采用納氏試劑分光光度法測(cè)定上清液中NH4+-N含量(氨氮增加量等于菌液中氨氮含量減去空白培養(yǎng)基中氨氮含量，單位：mg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、Mega7、GraphPad Prism等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及繪圖，利用Design Expert軟件進(jìn)行模型擬合和方差分析。所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨化細(xì)菌初篩和復(fù)篩結(jié)果

從精養(yǎng)池塘底泥中共分離出10株具有氨化作用的菌株。將菌株分別接種到氨化培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，測(cè)定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，不同菌株氨化能力不同，菌株ZXL-7的氨化能力最強(qiáng)，NH4+-N含量達(dá)到256.523 mg/L。故選擇菌株ZXL-7進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 氨化細(xì)菌ZXL-7的鑒定

2.2.1 氨化細(xì)菌ZXL-7的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

菌株形態(tài)如圖1所示。菌落為圓形，灰白色，不透明，表面濕潤(rùn)，邊緣規(guī)則，無(wú)色素產(chǎn)生。菌體為桿狀，兩端鈍圓，芽孢橢圓形，中生，革蘭氏陽(yáng)性(圖2)。

表4 菌株篩選結(jié)果Table 4 The results of strain screening

圖1 菌株ZXL-7菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of ZXL-7

圖2 菌株ZXL-7菌體及芽孢形態(tài)Figure 2 Morphology of bacteria and spores of strain ZXL-7

生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical experiments results

圖3 菌株ZXL-7 16S rDNA電泳圖Figure 3 16S rDNA electrophoresis of strain ZXL-7

2.2.2 16S rDNA序列分析結(jié)果

菌株16S rDNA擴(kuò)增序列電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，獲得的16S rDNA片段大小為1 489 bp。將測(cè)序結(jié)果與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)BLAST程序比對(duì)分析，利用軟件Mega7(neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

對(duì)比發(fā)現(xiàn)菌株ZXL-7與NR-117473.1:1-1488Bacillusmegateriumstrain ATCC 14581的同源性高達(dá)100%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和分子生物學(xué)分析結(jié)果，鑒定菌株ZXL-7為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。

2.3 氨化培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源種類對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

分別以3%的酒石酸鉀鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉替代氨化培養(yǎng)基中的葡萄糖，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，并計(jì)算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果如圖5所示。

圖4 菌株ZXL-7 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZXL-7

圖5 碳源種類對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 5 Effect of carbon sources on ammoniation of strain ZXL-7

圖5結(jié)果表明，不同碳源對(duì)菌株ZXL-7的氨化能力作用差異較大。當(dāng)以丁二酸鈉作為碳源時(shí)，菌株ZXL-7的氨化能力最強(qiáng)，培養(yǎng)液中氨氮增加量達(dá)325.926 mg/L。故選擇丁二酸鈉作為碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3.2 丁二酸鈉添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

在培養(yǎng)基中分別添加20、25、30、35、40 g/L的丁二酸鈉，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，并計(jì)算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果見(jiàn)圖6，在一定范圍內(nèi)培養(yǎng)液中氨氮增加量隨丁二酸鈉添加量的增加而上升，當(dāng)丁二酸鈉添加量為25.0 g/L時(shí)，氨氮增加量最高達(dá)366.67 mg/L，但當(dāng)丁二酸鈉添加量繼續(xù)增加時(shí)，氨氮增加量下降。

圖6 丁二酸鈉添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 6 Effect of sodium succinate addition on ammoniation effect of strain ZXL-7

2.3.3 氮源種類對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

以氨化培養(yǎng)基中的含氮量為基礎(chǔ)，分別加入等氮量的豆粕粉(1.5%)、酵母粉(1.5%)、蛋白胨(0.662%)、酵母提取物(0.873%)、胰蛋白胨(0.756%)，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，并計(jì)算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 氮源種類對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 7 Effect of nitrogen sources on ammoniation of strain ZXL-7

從圖7可以看出，以酵母粉為氮源時(shí)氨氮增加量顯著低于其它氮源且差異不顯著，原因可能是酵母粉是鮮酵母乳經(jīng)分離洗滌、干燥后制得，其蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，微生物利用速度和效率較低所致。當(dāng)以酵母提取物為氮源時(shí)，氨氮增加量最大，為465.74 mg/L。因此選擇酵母提取物為氮源進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3.4 KH2PO4添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

磷是微生物進(jìn)行正常生命活動(dòng)所必需的關(guān)鍵元素之一，是細(xì)胞中包括蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的重要組成，若培養(yǎng)基中缺磷，將影響微生物核酸、磷脂等生物大分子物質(zhì)的合成以及正常代謝過(guò)程。圖8結(jié)果表明，當(dāng)KH2PO4添加量為2.00 g/L時(shí)，培養(yǎng)液中氨氮增加量最大，為498.61 mg/L，但KH2PO4添加量繼續(xù)增加，氨氮增加量下降。故選擇KH2PO4添加量為2.00 g/L進(jìn)行后續(xù)研究。

圖8 KH2PO4添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 8 Effect of KH2PO4 addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.3.5 MgSO4·7H2O添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

鎂離子是微生物細(xì)胞中多種關(guān)鍵調(diào)控酶的活性中心組分，參與多種酶促反應(yīng)并維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從圖9可以看出，氨氮增加量呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為1.50 g/L時(shí)，氨氮增加量達(dá)到509.72 mg/L，但MgSO4·7H2O添加量繼續(xù)增加，氨氮增加量下降。原因是培養(yǎng)基中Mg2+濃度太高，對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，選擇MgSO4·7H2O添加量為1.50 g/L進(jìn)行后續(xù)研究。

圖9 MgSO4·7H2O添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 9 Effect of MgSO4·7H2O addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.3.6 MnSO4·H2O添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響

錳本身不構(gòu)成微生物細(xì)胞組分，但參與超氧化物歧化酶、檸檬酸合成酶等酶的組成，并對(duì)芽孢的形成具有一定的促進(jìn)作用。圖10結(jié)果表明，氨氮增加量在0.50 g/L MnSO4·H2O添加量下有最大值512.96 mg/L，但MnSO4·H2O添加量超過(guò)0.50 g/L時(shí)，氨氮增加量呈下降趨勢(shì)。

圖10 MnSO4·H2O添加量對(duì)菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 10 Effect of MnSO4·7H2O addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

通過(guò)Design Expert12.0.3.0軟件進(jìn)行方程擬合與顯著性分析，得到了氨氮增加量的二次多元回歸方程：

Y=574.31+44.28A+27.61B+35.95C-27.53D-

20.50AB-11.09AC-27.19AD-44.26BC-

7.56BD+9.39CD-45.93A2-59.74B2-

57.31C2-38.04D2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

表7 回歸方程方差分析Table 7 Analysis of regression model

由表7可知，模型P<0.000 1為極顯著，失擬項(xiàng)P=0.388 1>0.05，失擬度不顯著，說(shuō)明模型可行；相關(guān)系數(shù)R2=0.981 9，表示本實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值氨氮增加量同各因素之間相關(guān)性良好；校正決定系數(shù)R2=0.963 8，變異系數(shù)C.V.%=3.12，說(shuō)明該模型有良好的重現(xiàn)性，變異程度低。結(jié)合表中P值可知，丁二酸鈉(A)、KH2PO4(B)、MgSO4·7H2O(C)、丁二酸鈉和MnSO4·H2O的交互項(xiàng)(AD)、KH2PO4和MgSO4·7H2O的交互項(xiàng)(BC)以及丁二酸鈉的二次項(xiàng)(A2)、KH2PO4的二次項(xiàng)(B2)、MgSO4·7H2O的二次項(xiàng)(C2)、MnSO4·H2O的二次項(xiàng)(D2)為極顯著水平(P<0.01)，MnSO4·H2O(D)、丁二酸鈉和KH2PO4的交互項(xiàng)(AB)為顯著水平(P<0.05)，其它因素影響較小。

通過(guò)Design Expert12.0.3.0軟件對(duì)氨氮增加量的回歸方程進(jìn)行分析，丁二酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O各因素交互作用的響應(yīng)面見(jiàn)圖11。

從圖11可以看出，丁二酸鈉和MnSO4·H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O之間的交互作用極顯著(P<0.01)，丁二酸鈉和KH2PO4的交互作用顯著(P<0.05)，而丁二酸鈉和MgSO4·7H2O、KH2PO4和MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O之間的交互作用均不顯著。

根據(jù)模型可以得出適宜的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：丁二酸鈉添加量為28.04 g/L，KH2PO4添加量為2.05 g/L，MgSO4·7H2O添加量為1.58 g/L，MnSO4·H2O添加量為0.61 g/L，此時(shí)氨氮增加量理論產(chǎn)量為600.005 mg/L。將優(yōu)化所得培養(yǎng)基組成進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到氨氮增加量分別為590.556、583.661、598.889 mg/L，平均值為591.035 mg/L，與預(yù)測(cè)值相差1.49%。說(shuō)明該回歸模型可以用來(lái)優(yōu)化菌株ZXL-7氨化培養(yǎng)基組成，并且具有一定的準(zhǔn)確性。

圖11 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Figure 11 Response surface diagram of interaction of various factors

3 討論

本研究以蛋白胨為唯一氮源及高溫處理法從精養(yǎng)池塘底泥中分離得到10株具有氨化能力的芽孢桿菌，根據(jù)細(xì)菌經(jīng)典鑒定法并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，菌株ZXL-7鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。王娟[18]、侯穎[19]分別從南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池、養(yǎng)魚池水中分離篩選到氨化性能較高的巨大芽孢桿菌(Bacill-us megaterium)，并研究了其對(duì)有機(jī)氮的降解效果。

目前研究表明，細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等均具有降解有機(jī)氮的能力，但不同菌種對(duì)有機(jī)氮的降解能力不同。殘餌是養(yǎng)殖水體中營(yíng)養(yǎng)成分的主要來(lái)源，同時(shí)也是水體的主要污染物[20]。水體中的碳源、氮源等直接影響外源益生菌對(duì)水體的修復(fù)作用[21-23]。本研究表明，在以丁二酸鈉為碳源、酵母提取物為氮源的條件下，菌株ZXL-7具有較強(qiáng)有機(jī)氮的降解能力，說(shuō)明碳氮源種類和含量影響?zhàn)B殖水體中有機(jī)氮向氨氮的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響?zhàn)B殖水體中氮素的去除。磷元素、亞鐵等金屬離子均可影響微生物的脫氮能力[24-26]。當(dāng)環(huán)境中缺乏磷時(shí)，可降低糖類代謝速度，并可延遲生物濾池的啟動(dòng)時(shí)間[27]。礦質(zhì)元素雖不參與細(xì)胞骨架的組成，但對(duì)酶的激活有重要作用。在培養(yǎng)基中添加適量濃度的磷酸鹽、Mg2+等均可提高菌株ZXL-7對(duì)有機(jī)氮的降解能力。本試驗(yàn)篩選得到的巨大芽孢桿菌ZXL-7能有效降低養(yǎng)殖水體中有機(jī)氮的含量，并可應(yīng)用于養(yǎng)殖水體氮污染物的去除，但對(duì)有機(jī)氮的降解條件和機(jī)理、安全性以及使用方法等還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用平板分離法從精養(yǎng)池塘底泥中篩選得到1株高效氨化芽孢桿菌ZXL-7。通過(guò)經(jīng)典鑒定法并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)手段菌株ZXL-7鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了巨大芽孢桿菌ZXL-7適宜的氨化培養(yǎng)基組成為：丁二酸鈉28.04 g/L，KH2PO42.05 g/L，MgSO4·7H2O 1.58 g/L，MnSO4·H2O 0.61 g/L，酵母提取物8.73 g/L，NaCl 3 g/L，此條件下，氨氮增加量達(dá)591.035 mg/L。說(shuō)明本研究篩選的菌株可以用于養(yǎng)殖水體有機(jī)氮的降解，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。