液相色譜–光譜圖法定性確證食品中苯甲酸、山梨酸

馬長(zhǎng)海，于明明，閆吉昌，辛若竹

（1.白城市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林白城 137000；2.梅河口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，吉林梅河口 135000）

目前，苯甲酸和山梨酸是食品中應(yīng)用最廣泛的防腐劑，由于其防腐效果好，價(jià)格便宜深受食品加工業(yè)的青睞，但苯甲酸和山梨酸超標(biāo)、超范圍使用會(huì)對(duì)人身健康造成一定程度的損害。GB 2760—2014 《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［1］中嚴(yán)格規(guī)定了苯甲酸和山梨酸的使用范圍和使用限量，并且我國(guó)已將苯甲酸和山梨酸列為食品安全日常監(jiān)測(cè)的必檢項(xiàng)目。目前苯甲酸和山梨酸的主要檢測(cè)方法有液相色譜法［2–8］、氣相色譜法［8–10］和超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［11–12］，其中液相色譜法因其設(shè)備適用性好、檢測(cè)成本低、樣品前處理簡(jiǎn)單而成為首選檢測(cè)方法。由于色譜分析是以色譜峰的保留時(shí)間定性，而食品種類繁多且基質(zhì)復(fù)雜，同一保留時(shí)間常有干擾峰出現(xiàn)，且苯甲酸、山梨酸的保留時(shí)間常受樣品溶液pH 值的影響有所波動(dòng)［13–14］，因此苯甲酸、山梨酸除了以保留時(shí)間定性外，還應(yīng)根據(jù)不同物質(zhì)具體光譜特性，利用光譜信息進(jìn)一步定性確證［15–16］，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品。

筆者在GB 5009.28—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》的基礎(chǔ)上，當(dāng)色譜圖中出現(xiàn)干擾峰或可疑峰需要定性確證時(shí)，利用液相色譜儀DAD 檢測(cè)器全光譜掃描功能分別采集標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的光譜圖，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸、山梨酸的光譜圖與樣品溶液中可疑峰光譜圖的重合性，進(jìn)一步定性確證樣品中可疑色譜峰是否為苯甲酸、山梨酸，避免了實(shí)際工作中因定性失誤而出現(xiàn)誤判的事件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

渦旋混合器：重載數(shù)顯型，轉(zhuǎn)速為300～3 500 r/min，美國(guó)Talboys 公司。

超聲波清洗器：KQ–500DE 型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：KH20R–Ⅱ型，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)飛世爾科技公司。

甲酸：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

乙酸銨：優(yōu)級(jí)純，英國(guó)阿法埃莎化學(xué)有限公司。

苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.9%、99.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

食品樣品：干豆腐，白腐乳，醬油，蛋糕，面包，冷面，醬鹵豬頭肉，市售。

實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC–C18柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：2 mmol/L 甲酸與20 mmol/L 乙酸銨混合溶液–甲醇（95∶5，體積比，下同），流量為0.4 mL/min；分析波長(zhǎng)：230 nm；DAD 檢測(cè)器全光譜采集：波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，步進(jìn)值為2.0 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液配制

2 mmol/L 甲酸與20 mmol/L 乙酸銨混合溶液：稱取1.54 g 優(yōu)級(jí)純乙酸銨，用適量水溶解，再加入75.2 μL 甲酸，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后備用。

數(shù)據(jù)中心總耗電量的測(cè)量可將M1點(diǎn)和M2點(diǎn)測(cè)得的耗電量相加。大多數(shù)數(shù)據(jù)中心的供電系統(tǒng)會(huì)配備柴油發(fā)電機(jī)，作為應(yīng)急備用電源，而柴油發(fā)電機(jī)工作時(shí)也會(huì)帶來(lái)電能的損耗，該損耗不能被忽略。因此，數(shù)據(jù)中心總耗電的測(cè)量應(yīng)包含市電和柴油發(fā)電機(jī)兩部分。而數(shù)據(jù)中心中往往會(huì)附帶一些配套設(shè)施，如辦公，這部分功能所消耗的電量不應(yīng)計(jì)入PUE的范圍內(nèi)，因此M4點(diǎn)測(cè)出的電量應(yīng)以扣除。

苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別準(zhǔn)確稱取苯甲酸、山梨酸各0.01 g，用甲醇溶解并分別定容至10 mL。

苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：各組分質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，分別準(zhǔn)確吸取苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各5.0 mL 于50 mL 容量瓶中，用水定容。

苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：各組分質(zhì)量濃度均為10 μg/mL，準(zhǔn)確吸取苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取食品樣品2 g 于50 mL 具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，超聲20 min，加92g/L亞鐵氰化鉀溶液2mL和183g/L乙酸鋅溶液2mL，混勻，以8000 r/min 離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，以8 000 r/min 離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL 容量瓶中，并用水定容至標(biāo)線，混勻。取適量上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.5 定性分析

向液相色譜儀中分別進(jìn)樣苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和樣品溶液各10 μL，經(jīng)色譜柱分離后，于230 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)，在以保留時(shí)間定性，并利用DAD 檢測(cè)器全光譜掃描功能分別采集苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的光譜圖，通過(guò)比較混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸、山梨酸的光譜圖與樣品溶液中可疑峰光譜圖的重合性（光譜圖信息），進(jìn)一步定性確證樣品中可疑峰是否為苯甲酸、山梨酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

參照文獻(xiàn)［8］的色譜條件，以Agilent Poroshell 120 EC–C18色譜柱分離，以2 mmol/L 甲酸與20 mmol/L 乙酸銨混合溶液–甲醇（95∶5）為流動(dòng)相洗脫，于230 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)，苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1 所示。由圖1 可知，苯甲酸、山梨酸的色譜保留時(shí)間分別為9.169、17.782 min。

圖1 苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 樣品中苯甲酸、山梨酸定性確證

分別選取市售代表性食品干豆腐、白腐乳、醬油、蛋糕、面包、冷面、醬鹵豬頭肉共7 種樣品，按照1.4 方法進(jìn)行樣品處理，在1.2 色譜條件下分別采集色譜圖和光譜圖，如圖2～圖12 所示。將樣品與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、光譜圖相比較。以保留時(shí)間定性，由色譜圖中可知：干豆腐中檢出苯甲酸和山梨酸色譜峰（圖2）；白腐乳中檢出苯甲酸色譜峰，未檢出山梨酸色譜峰（圖3）；醬油中檢出苯甲酸色譜峰，未檢出山梨酸色譜峰（圖4）；蛋糕、面包、冷面中均檢出山梨酸色譜峰，未檢出苯甲酸色譜峰（圖5）；醬鹵豬頭肉中檢出苯甲酸色譜峰，未檢出山梨酸色譜峰（圖6）。

圖2 干豆腐樣品色譜圖

圖3 白腐乳樣品色譜圖

圖4 醬油樣品色譜圖

圖5 蛋糕、面包、冷面樣品色譜圖

圖6 醬鹵豬頭肉樣品色譜圖

圖7、圖8 分別是苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的苯甲酸、山梨酸光譜圖。通過(guò)對(duì)比可知：干豆腐中苯甲酸光譜圖與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸光譜圖完全重合，山梨酸光譜圖（圖9）完全不重合（峰起點(diǎn)、峰頂點(diǎn)和峰落點(diǎn)均不同），可確證干豆腐中苯甲酸為陽(yáng)性，山梨酸為假陽(yáng)性；白腐乳苯甲酸光譜圖與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸光譜圖（圖10）完全不重合（峰起點(diǎn)、峰頂點(diǎn)和峰落點(diǎn)均不同），可確證白腐乳中苯甲酸為假陽(yáng)性；醬油中苯甲酸光譜圖與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸光譜圖完全重合，可確證醬油中苯甲酸為陽(yáng)性；蛋糕、面包、冷面3 種樣品中山梨酸光譜圖均與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的山梨酸光譜圖完全重合，可確證3 種樣品中山梨酸均為陽(yáng)性；醬鹵豬頭肉中苯甲酸光譜圖與苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸光譜圖（圖11）完全不重合（峰起點(diǎn)、峰頂點(diǎn)和峰落點(diǎn)均不同），可確證豬頭肉中苯甲酸為假陽(yáng)性。

圖7 苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸光譜圖

圖8 苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中山梨酸光譜圖

圖9 干豆腐樣品山梨酸光譜圖

圖10 白腐乳樣品苯甲酸光譜圖

圖11 鹵醬豬頭肉樣品苯甲酸光譜圖

2.3 樣品數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量判定

將上述樣品中苯甲酸、山梨酸的定性、定量結(jié)果列入表1。

表1 樣品中苯甲酸、山梨酸定性、定量結(jié)果

由表1 可知，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，單一以保留時(shí)間定性，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性情況（如干豆腐中山梨酸，白腐乳中苯甲酸、豬頭肉中苯甲酸均為假陽(yáng)性）；而根據(jù)保留時(shí)間和光譜圖信息兩方面進(jìn)行綜合分析定性，才能保證樣品檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。根據(jù)GB 2760 規(guī)定，豆類制品中不得使用苯甲酸，干豆腐樣品中苯甲酸含量為0.029 g/kg，故判定為不合格樣品；小麥粉制品中不得使用山梨酸，冷面中山梨酸含量為0.015 8 g/kg，故判定為不合格樣品；其余樣品白腐乳、醬油、蛋糕、面包、豬頭肉中苯甲酸、山梨酸含量均符合GB 2760 規(guī)定，判定為合格樣品。

3 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用高效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器分別采集苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖、光譜圖，利用色譜圖中保留時(shí)間定性的同時(shí)，利用光譜信息進(jìn)一步定性確證，避免單一以保留時(shí)間定性而出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品，在實(shí)際檢測(cè)工作中取得了理想的應(yīng)用效果。