微波萃取–高效液相色譜熒光檢測法測定食品包裝用紙中11 種熒光增白劑

周良春，馬俊輝，張曉飛，文彬羽，李雙琦，楊婷

［成都產品質量檢驗研究院有限責任公司，國家包裝產品質量檢驗檢測中心（成都），成都市產品質量監(jiān)督檢驗研究院，成都 610100］

熒光增白劑（FWA）是一種能吸收太陽光中不可見的紫外光，再發(fā)射出可見藍紫色熒光的有機化合物［1–2］，該過程可淡化產品中的灰白色或微黃色，提高產品的亮度。因此，熒光增白劑在造紙、塑料制品、洗滌劑和化妝品等行業(yè)中得到廣泛的應用［3–6］。但是，熒光增白劑對人體有害，若長期接觸或者攝入會削弱人體免疫力和傷口愈合能力［7］，甚至會有致癌的風險［8］。一些生產企業(yè)為了提高紙的增白效果，常將其用于紙及其制品（特別是食品包裝用紙）中。食品包裝用紙中的熒光增白劑可能會遷移至食品中，從而被人體吸收，對消費者的身體健康造成嚴重的損害。現(xiàn)行國家標準GB 4806.8—2016［9］明確規(guī)定食品包裝用紙中不得檢出熒光性物質。

目前，熒光增白劑的檢測方法主要有紫外燈照射法［10］、紫外分光光度法［11］、熒光分光光度法［1，12］、高效液相色譜熒光檢測法［2，8，13–17］和超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法［18–19］。紫外燈照射法只能定性檢測；紫外分光光度法和熒光光度法可以定量，但只能測定熒光增白劑總量；超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法靈敏度高，能準確定性和定量，但儀器價格昂貴，檢測成本較高，不利于實驗室普及，且對預處理后的樣品溶液凈化要求較高；高效液相色譜法儀器價格相對較低，檢測靈敏度較高，操作簡便。利用高效液相色譜儀測定食品接觸用紙中熒光增白劑含量已有文獻報道［3，8，14，16］，樣品處理均用超聲萃取儀。用微波萃取的方法提取食品包裝用紙中的熒光增白劑未見報道。

筆者建立一種微波萃取高效液相色譜測定食品包裝用紙中11 熒光增白劑含量的方法，縮短了樣品萃取時間，提高了檢測效率，降低了有機溶劑用量。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ultimate 3000 型，配FLD 檢測器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

純水/超純水一體化系統(tǒng)：Milli-Q Direct 16 型，美國密理博公司。

電子分析天平：ME204E–02 型，感量為0.1 mg，梅特勒–托利多儀器（上海）有限公司。

密閉式高通量微波消解/萃取儀：JUPITER A型，上海新儀微波化學科技有限公司。

智能酸度計：pHS–4C+型，分辨率可調（0.001，0.01，0.1），成都世紀方舟科技有限公司。

11 種熒光增白劑標準溶液：質量濃度均為100 μg/mL，福州綠川生物科技有限公司，各化合物CAS 號，化學式及代號、生產批號等信息見表1。

甲醇、乙腈和乙醇：均為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

三乙胺：分析純，成都市科隆化學品有限公司。

四丁基溴化銨：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

乙腈–水溶液：分別量取乙腈40 mL 和超純水60 mL，將二者混合，再向混合液中準確加入0.6 mL分析純三乙胺，攪拌，混合均勻。

食品包裝紙樣品：市售食品包裝紙。

實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

分別移取一定體積11 種熒光增白劑標準溶液于50 mL 容量瓶中，用乙腈–水溶液定容，配制成各組分質量濃度均為1 000 μg/L 的混合標準儲備液，于4℃保存，有效期為一個月。

用乙腈–水溶液將11 種熒光增白劑混合標準儲備液稀釋至各組分質量濃度均分別為2、10、20、40、80、100、150 μg/L 的系列混合標準溶液。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Kromasil 100–5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Akzo Nobel 公司）；柱溫：35 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：激發(fā)波長為362 nm，發(fā)射波長為410 nm；流動相：A 為甲醇–乙腈溶液（體積比為3∶2），B 為25 mmol/L 四丁基溴化銨溶液（含體積分數(shù)為5%的甲醇，并用三乙胺調節(jié)溶液pH 為8.0）；流動相流量：1.0 mL/min；梯度洗脫程序如表2 所示。

表2 梯度洗滌程序

1.4 實驗方法

1.4.1 陽性樣品的制備

將食品接觸用包裝用紙用剪刀剪成約為0.5 cm×0.5 cm 碎片，稱取約0.25 g樣品（精確至0.1 mg），置于微波萃取罐中，向其中加入一定量的熒光增白劑混合標準溶液，混勻，避光于4 ℃冰箱中存放24 h，待充分吸收后待測。

1.4.2 樣品分析

將樣品用剪刀剪成約為0.5 cm×0.5 cm 碎片，稱取約0.25 g 樣品（精確至0.1 mg），加入20 mL 乙腈–水溶液，于80 ℃微波萃取15 min，冷卻，將提取液轉移至25 mL 容量瓶中，再加入5 mL 上述萃取溶液洗滌，合并提取液，定容至標線，混勻，取2 mL提取液，過孔徑為0.45 μm 的濾膜，用高效液相色譜儀測分析測定，以色譜峰面積標準曲線法定量。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1 激發(fā)波長和發(fā)射波長

利用液相色譜儀配置的熒光檢測器對11 種熒光增白劑混合標準溶液進行光譜掃描，該11 種熒光增白劑的最大激發(fā)波長在360～363 nm 范圍內，最大發(fā)射波長在408～410 nm 范圍內。當選擇激發(fā)波長為362 nm、發(fā)射波長為410 nm 時各物質均有較高熒光響應值，11 種熒光增白劑混合標準溶液3D光譜掃描如圖1 和圖2 所示。

圖1 11 種熒光增白劑混合標準溶液的激發(fā)光譜圖

圖2 11 種熒光增白劑混合標準溶液的發(fā)射光譜圖

2.1.2 流動相

選取Kromasil 100–5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，進樣體積選擇20 μL，流動相流量選擇1.0 mL/min。常用柱溫為室溫，升高柱溫可以縮短液相色譜分析時間，提高檢測效率。本次目標分析物有11 種，數(shù)量較多，當選擇柱溫為35℃時，各物質均能較好分離，且在18 min 內完全出峰。

甲醇和乙腈是液相色譜儀常用有機流動相。11種熒光增白劑含有磺酸基和苯基，可溶解于有機溶劑與水的混合溶液中，特別是乙腈的水溶液。標準混合溶液溶劑為乙腈水溶液，說明11 種熒光增白劑在乙腈水溶液中能較好的溶解。試驗結果表明，若只用40%乙腈水溶液作為流動相，11 種熒光增白劑不能有效分離。參考韓曉鷗等［20］所提出的儀器條件，選擇乙腈–甲醇溶液（體積比為3∶2）為流動相A，調節(jié)流動相B 進行優(yōu)化。當流動相B 為體積分數(shù)5%的甲醇水溶液時，11 種熒光增白劑完全不能分離開，如圖3（a）所示。因為11 種熒光增白劑分子中含有多個磺酸基團，極性較強，在C18柱中保留較差，均在3 min 內全部出峰。為了增強其在C18柱上的保留，加入正離子對試劑四丁基溴化銨（TBA）與磺酸基團結合來減小極性。所以，當流動相B 為10 mmol/L 四丁基溴化銨水溶液（含體積分數(shù)為5%的甲醇，并用三乙胺調節(jié)溶液pH 為8.0）時，11 種熒光增白劑除FWA 264 和FWA 353 外，其它均能較好分離，如圖3（b）所示。當流動相B 中四丁基溴化銨的濃度增加至25 mmol/L 時，11 種熒光增白劑均能夠完全分離，如圖3（c）所示。同時，該類物質中含有多個磺酸基團，需要在堿性條件下才能確保待測物在與離子對試劑結合前充分離子化。韓曉鷗等［20］研究表明，pH 值為9.5～10 時，色譜峰會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。本實驗結果表明：當pH 為8.0 時，各物質色譜峰均較好。因此，流動相B 選擇25 mmol/L四丁基溴化銨水溶液（含體積分數(shù)為5%的甲醇，并用三乙胺調節(jié)溶液pH 為8.0）。

圖3 不同流動相對應的11 種熒光增白劑的色譜圖

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 萃取溶劑

11 種熒光增白劑均為陰離子熒光增白劑，含有較多的非水溶性苯環(huán)，所以選擇有機溶劑與水的混合溶液作為提取試劑。分別選擇40%的乙腈–水、甲醇–水、乙醇–水溶液（均含0.6%的三乙胺）和乙腈–水溶液（不含三乙胺）作萃取劑，加入到已知含量的自制陽性樣品中，按照1.4.3 的處理方法進行提取，計算各種熒光增白劑的回收率，繪制柱狀圖如圖4 所示。

圖4 不同混合溶劑提取時11 種熒光增白劑的回收率

由圖4 可知，提取效率從大到小依次為：乙腈–水溶液（含三乙胺）＞甲醇–水溶液＞乙腈–水溶液＞乙醇–水溶液。提取效率最好的溶劑為乙腈–水溶液（含三乙胺），這是因為該類陰離子型熒光增白劑在堿性條件下以離子形式存在，更易被提取。乙醇–水–三乙胺體系中的三乙胺使萃取液呈堿性，利于磺酸基以離子形式存在，但是該類化合物中的苯環(huán)等疏水基團在乙醇中溶解度很低，使乙醇–水溶液的萃取效率最低。

為了進一步優(yōu)化萃取溶劑中乙腈與水的混合比例，分別選取乙腈與水的體積比為1∶4、2∶3、3∶2和4∶1（均含有0.6%的三乙胺）對陽性樣品進行微波提取，試驗結果如圖5 所示。由圖5 可知，當乙腈與水的體積比為2∶3 時，各種熒光增白劑的回收率均在80%以上，提取效率最高。隨著水含量降低，各種熒光增白劑的回收率均迅速減小。這是因為熒光增白劑的磺酸基團為水溶性的，隨著萃取劑中水含量降低，溶于萃取劑的熒光增白劑減少。綜合考慮，選取乙腈–水的體積比為2∶3（含0.6%的三乙胺）作為萃取溶劑。

圖5 不同配比乙腈和水萃取11 種熒光增白劑的回收率

萃取劑中三乙胺的主要作用是調節(jié)pH 值，使溶液呈堿性，以便各物質充分離子化和溶解?？疾烊野返捏w積分數(shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%時11 種熒光增白劑的熒光響應，結果表明，隨著三乙胺含量增大，熒光增白劑FWA 220 的響應值也增大，當三乙胺體積分數(shù)為0.6%時，F(xiàn)WA 220的響應值不再變化，其余物質響應無明顯變化。因此選擇三乙胺體積分數(shù)為0.6%。

2.2.2 萃取時間

稱取約0.25 g自制陽性樣品（4份）于萃取罐中，分別向其中加入20 mL 乙腈–水溶液，于80 ℃分別微波萃取5、10、15 和20 min，考察萃取時間對熒光增白劑回收率的影響，試驗結果如圖6 所示。

圖6 不同萃取時間11 種熒光增白劑的回收率

由圖6 可知，當萃取時間為15 min 時，各種熒光增白劑提取效率均達到較高水平（80%以上），萃取時間繼續(xù)延長，回收率增大不明顯。因此選擇萃取時間為15 min。

2.2.3 萃取溫度

分別選擇萃取溫度為60、70、80 和90℃，考察萃取溫度對各種熒光增白劑回收率的影響。按照1.4.2樣品處理方法，對自制陽性樣品進行提取和測定，計算各種熒光增白劑的回收率，結果如圖7 所示。

圖7 不同萃取溫度時11 種熒光增白劑的回收率

由圖7 可知，隨著萃取溫度的升高，各種熒光增白劑的回收率逐漸提高，當萃取溫度為80 ℃時，各種熒光增白劑回收率均大于80%，溫度繼續(xù)升高回收率提高不明顯。因此選取萃取溫度為80 ℃。

2.3 線性范圍、相關系數(shù)、方法檢出限和定量限

按照1.4.1 方法配制11 種熒光增白劑質量濃度均分別為2、10、20、40、80、100、150 μg/L 的系列混合標準溶液，在1.3 條件下測定。以各種熒光增白劑質量濃度為橫坐標（X）、色譜峰峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算線性方程及相關系數(shù)。

用空白樣品加標的方法，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應的標準溶液質量濃度作為各種熒光增白劑的方法檢出限和定量限。

11 種熒光增白劑的質量濃度線性范圍、線性方程、線性相關系數(shù)、檢出限和定量限列于表3。由表3 可知，11 種熒光增白劑在2～150 μg/L 的質量濃度范圍內，線性相關系數(shù)均不小于0.999 6，表明線性關系良好，滿足測試要求。當稱樣量為0.25 g、定容體積為25 mL 時，樣品中11 種熒光增白劑的檢出限為0.1～0.2 mg/kg，定量限為0.3～0.6 mg/kg。

表3 11 種熒光增白劑質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 加標回收和精密度試驗

采用向陰性樣品中加入標準溶液的方式進行加標回收試驗。選擇未檢出熒光增白劑的食品接觸用紙作為陰性樣品，分別添加2.0、20.0 和100.0 μg/L 低、中、高3 個濃度水平的11 種熒光增白劑混合標準溶液，每個加標水平平行測定6 次，11 種熒光增白劑測定值、回收率和測定結果的相對標準偏差列于表4。

表4 加標回收和精密度試驗結果（n=6）

由表4 可知，11 種熒光增白劑的加標回收率為86.0%～108.4%，相對標準偏差為0.4%～4.9%（n=6），表明該方法準確度和精密度良好，可用于食品接觸用紙制品中熒光增白劑的檢測。

3 結語

建立了檢測食品包裝用紙中11 種熒光增白劑的微波萃取高效液相色譜方法。該法樣品處理快速、簡便，使用有機溶劑少。該方法具有干擾小、分離效果好、靈敏度高、定量準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。