布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)水平、肝功能、血液流變學(xué)及肝臟病理形態(tài)的影響

黃雪君 楊九妹 畢曉黎 蔡大可 甘海寧 陳玉興

隨著代謝性疾病患病率的增加，非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為最常見(jiàn)慢性肝病之一。肥胖、糖尿病和血脂代謝異常是最危險(xiǎn)因素[1-2]。NAFLD的全球患病率約為25%，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到 28.4%[3]。NAFLD有可能進(jìn)展為非酒精脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。中醫(yī)認(rèn)為脾虛肝郁，痰濁瘀滯為非酒精性脂肪肝的主要病因病機(jī)，古代經(jīng)方及臨床驗(yàn)方等均在治療NAFLD取得較好的治療效果。李金生認(rèn)為由于痰阻、血瘀及氣滯單個(gè)或多個(gè)相互為患，誘發(fā)氣滯脂停，久則形成脂肪肝，臨床治以健脾疏肝降脂湯加減[4]。參苓白術(shù)散對(duì)mTORC1、STAT3 相關(guān)基因的抑制，改善肝臟炎性反應(yīng)及脂肪蓄積[5]。柴胡疏肝散通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路InsR-β、FOXO1A 的表達(dá)，改善肝郁氣滯型脂肪肝模型大鼠脂代謝[6]。茵陳苓桂劑可調(diào)節(jié)血脂和肝酶，保護(hù)肝功能，起到防治非酒精性脂肪肝病的作用[7]。單味中藥及提取物[8-9]亦作用于不同靶點(diǎn)對(duì)非酒精性脂肪肝起一定作用，荷葉、青蒿、蒲公英等提取物，通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/PPARγ、MAPK、AMPK等通路，改善血脂水平、炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗，防止肝組織脂肪化。

布芍調(diào)脂膠囊(BushaoTiaozhiCapsule，BSTZC)，是由布渣葉、赤芍、莪術(shù)、穿心蓮組成的中藥六類(lèi)新藥，主治高脂血癥之氣滯血瘀或兼有痰濁濕熱。該新藥已獲臨床試驗(yàn)批件(2016L02809)，目前正開(kāi)展Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)降低肝臟脂質(zhì)水平有一定作用，因此，本研究將觀察布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠模型的影響，初步探討其對(duì)非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

阿托伐他汀鈣片(輝瑞有限公司，批號(hào)：CF2681)；布芍調(diào)脂膠囊(國(guó)藥集團(tuán)環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20191012)膽固醇 (total cholesterol, TC) 試劑盒，甘油三酯(triglyceride, TG) 試劑盒，低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C) 試劑盒，高密度脂蛋白 (high density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)為：20191119、20191119、20200227、20200227；丙 氨 酸 氨基 轉(zhuǎn) 移 酶 (alanine a minotransferase，ALT)測(cè)定試劑盒，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine a minotransferase，AST)測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自廣州科方生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)為：200521、200521、200406。

1.2 動(dòng)物與飼料

SPF級(jí)SD大鼠48只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，分6組，每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200072612。購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (粵)2018-0002，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)SYXK(粵)2015-0059。大鼠高脂飼料, 購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：20191105。

1.3 儀器

BS224S電子天平(1/萬(wàn))，德國(guó)Sartorius公司； 5418型小型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)血流變學(xué)分析儀，北京普利生儀器有限公司；7010生化分析儀，日本日立公司；Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；BX51型熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.4 造模與給藥

48只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、阿托伐他汀組(1.8 mg/kg)，布芍調(diào)脂膠囊高劑量組(5.76 g生藥/kg)、布芍調(diào)脂膠囊中劑量組(2.88 g生藥/kg)及布芍調(diào)脂膠囊低劑量組(1.44 g生藥/kg)，每組各8只，正常組定量給予普通飼料，其余組定量給予高脂飼料(蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預(yù)混料0.4%、基礎(chǔ)飼料52.2%)，連續(xù)8周。各給藥組每天按劑量給予相應(yīng)藥物灌胃，給藥劑量按臨床用量根據(jù)體表面積折算[10]，正常組、模型組同法給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)4周。給藥期間，各組大鼠造模方法同前述。

1.5 標(biāo)本采集

末次給藥前12小時(shí)禁食不禁水。末次給藥后1小時(shí)，記錄大鼠體重，將大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3000 rpm離心10分鐘，取血清用于生化檢測(cè)，另肝素抗凝用于血液流變學(xué)檢測(cè)；取出肝臟大體觀察及稱(chēng)重后，一部分-80℃保存用于檢測(cè)肝臟脂質(zhì)水平，另一部分置于中性甲醛溶液固定作病理檢查。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

肝臟病理形態(tài)檢測(cè)：將用中性甲醛溶液固定的肝臟，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色和油紅O染色，顯微鏡觀察記錄肝細(xì)胞形態(tài)變化。肝臟系數(shù)計(jì)算：根據(jù)大鼠體重和肝臟重量，計(jì)算肝臟系數(shù)：肝臟系數(shù)(%)=肝臟濕重/大鼠體重×100%。血脂水平的檢測(cè)：根據(jù)試劑盒檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。肝臟脂質(zhì)水平的檢測(cè)：根據(jù)試劑盒檢測(cè)肝臟中TC、TG水平。生化指標(biāo)的檢測(cè)：全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中ALT、AST、SOD的含量。血液流變學(xué)分析：血流變學(xué)分析儀測(cè)量各個(gè)樣品的高切全血粘度、中切全血粘度、低切全血粘度。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟解剖形態(tài)的影響

如圖1所示，正常組肝臟顏色暗紅，表面光滑完整，彈性好且邊緣銳利。模型組肝臟顏色變淡，呈淡紅色，表面顆粒感及油膩感較重，質(zhì)粗糙，彈性減弱且邊緣鈍；與模型組比較，各給藥組肝臟大部分表面顏色暗紅，彈性較好，表面稍顯顆粒感及油膩感，形態(tài)明顯改善。

圖1 各組大鼠肝臟解剖形態(tài)

2.2 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

如圖2.a所示，正常組肝臟細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，無(wú)空泡樣病變及脂滴的產(chǎn)生。模型組細(xì)胞排列無(wú)序，體積增大，可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，且出現(xiàn)細(xì)胞空泡樣病變及脂滴；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性程度輕，細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞空泡樣病變及脂滴的數(shù)量明顯減少。

經(jīng)油紅O染色后，肝臟細(xì)胞中的脂滴呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無(wú)色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.b所示，正常組肝臟細(xì)胞排列整齊，無(wú)紅色脂滴產(chǎn)生。模型組細(xì)胞出現(xiàn)大量紅色脂滴，脂質(zhì)浸潤(rùn)明顯；與模型組比較，各給藥組紅色脂滴明顯減少，脂質(zhì)浸潤(rùn)有所改善。

2.3 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟系數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝臟系數(shù)顯著性升高(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組大鼠肝臟系數(shù)顯著性降低(P<0.01)，布芍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組大鼠肝臟系數(shù)顯著性降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟系數(shù)的影響

2.4 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血脂水平的影響

與正常組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平顯著性升高(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組和布芍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組血清TC、TG、LDL-C水平顯著性降低(P<0.01)。

與正常組比較，模型組血清HDL-C水平顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，布芍調(diào)脂膠囊高劑量組血清HDL-C水平顯著性升高(P<0.01)，阿托伐他汀組血清HDL-C水平顯著性升高(P<0.05)，布芍調(diào)脂膠囊低、中劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影響

2.5 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

與正常組比較，模型組肝臟TC、TG水平顯著性升高(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組和布芍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組肝臟TC、TG水平顯著性降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟中TC、TG含量的影響

2.6 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠生化指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組ALT、AST水平顯著性升高(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組和布芍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組ALT、AST水平顯著性降低(P<0.01)。

注：a.大鼠肝臟HE染色，200× b.大鼠肝臟油紅O染色，200×

與正常組比較，模型組SOD水平顯著性降低(P<0.01)； 與模型組比較，阿托伐他汀組SOD水平顯著性升高(P<0.05)，布芍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組SOD水平顯著性升高(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠ALT,AST,SOD含量的影響

2.7 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血液流變學(xué)的影響

與正常組比較，模型組全血黏度低、中、高切均顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組和布芍調(diào)脂膠囊高、中劑量組全血黏度低、中、高切顯著性升高(P<0.01)，布芍調(diào)脂膠囊低劑量組全血黏度中切顯著性升高(P<0.05)，布芍調(diào)脂膠囊低劑量組全血黏度高切顯著性升高(P<0.01)，布芍調(diào)脂膠囊低劑量組全血黏度低切無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 布芍調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血液流變學(xué)的影響

3 討論

血脂水平和肝功能檢查在臨床上是脂肪肝的主要檢查手段，可反映脂肪肝的進(jìn)程。脂肪被機(jī)體過(guò)量攝入，超出正常范圍時(shí)，其在肝臟堆積，從而轉(zhuǎn)化成TG，TG水平迅速上升，形成脂肪肝[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，布芍調(diào)脂膠囊給藥后，可有效降低非酒精性脂肪肝模型大鼠血液及肝臟中的TC、TG水平，同時(shí)，肝臟病理形態(tài)明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性程度較輕，脂滴的數(shù)量明顯減少，肝臟系數(shù)明顯減少。

ALT、AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，作為反映肝功能的兩個(gè)主要指標(biāo)[12]，ALT在肝細(xì)胞受損后可進(jìn)入血液；如肝細(xì)胞進(jìn)一步受損，會(huì)對(duì)線粒體造成威脅，AST也將進(jìn)入到血液中[13]。因此，當(dāng)檢查中出現(xiàn)ALT、AST水平顯著上升，說(shuō)明脂肪肝加重，肝臟受損嚴(yán)重[14]。SOD作為自由基主要的代謝酶，能夠清除超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞的損害，參與在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，布芍調(diào)脂膠囊能明顯下調(diào)非酒精性脂肪肝模型大鼠的血清ALT、AST，提高SOD含量，具有保護(hù)肝功能及抗氧化的能力。

血液流變學(xué)是研究血液的流動(dòng)性和形變規(guī)律，可反映血液粘度與凝固性的改變，與高脂血癥、高血壓、冠心病等心血管疾病關(guān)系密切。血中大量大分子脂蛋白吸附在紅細(xì)胞和血小板上[15-16]，使膜表面的負(fù)荷減少，排斥力降低，進(jìn)而提高黏附聚集力，升高血液的黏度。血液黏度升高，是血瘀形成的重要病理生理基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組全血粘度高切、中切、低切均顯著性降低，提示非酒精性脂肪肝大鼠血液粘度增高；給予布芍調(diào)脂膠囊后，大鼠全血粘度高切、中切、低切均顯著性升高，布芍調(diào)脂膠囊能降低血液粘度，具有一定的活血祛瘀作用。

中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD病機(jī)主要是痰濁與血瘀，脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與痰濁、瘀血密不可分[17-18]。在NAFLD中，“痰”及“瘀”的病理表現(xiàn)之一為肝脂、血脂過(guò)多，血液粘度變大，肝臟中過(guò)多的脂質(zhì)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)而引起肝臟損傷。布芍調(diào)脂膠囊具有消食化痰、活血祛瘀功效，其能有效降低血清及肝臟脂質(zhì)水平，保護(hù)肝功能，同時(shí)改善血液粘度，對(duì)脂肪肝起到較好的治療作用。布芍調(diào)脂膠囊是多靶點(diǎn)作用于脂質(zhì)代謝，在今后研究中，可針對(duì)糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)及信號(hào)通路進(jìn)行研究，以進(jìn)一步闡明布芍調(diào)脂膠囊治療NAFLD 的作用機(jī)制。