歸術(shù)益坤方對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織及SIRT1-FOXO信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

徐道立 林青 陳穎 李晶晶 佟慶

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以內(nèi)分泌紊亂為主、多種代謝異常導致的異質(zhì)性臨床綜合征[1]，中國育齡期婦女中PCOS發(fā)病率達到6%～10%[2]，但其病因及發(fā)病機制目前仍未完全明確。SIRT1基因可通過調(diào)控多種下游蛋白表達及促進類固醇激素合成關(guān)鍵酶表達等多種途徑影響PCOS發(fā)病[3]。歸術(shù)益坤方是國醫(yī)大師柴嵩巖治療PCOS的經(jīng)驗方，主要以補腎健脾、養(yǎng)血通利為法，并以“二陽致病”理論為指導，運用補肺啟腎之法，從而緩解脾腎不足、痰濕結(jié)聚的病理狀態(tài)，促進卵巢功能恢復及月經(jīng)來復。前期研究證實，歸術(shù)益坤方能顯著下調(diào)PCOS患者血清睪酮、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)及卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平，改善相關(guān)癥狀，提高妊娠率[4]。細胞實驗證實，歸術(shù)益坤方能通過調(diào)控P53/AMPK通路影響卵巢顆粒細胞自噬，改善PCOS發(fā)病[5]。本研究旨在通過建立大鼠PCOS模型，以炔雌醇環(huán)丙孕酮片作為陽性對照藥，探究歸術(shù)益坤方對PCOS大鼠卵巢形態(tài)學、血清學及SIRT-FOXO通路相關(guān)蛋白的影響，進一步明確歸術(shù)益坤方治療PCOS的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級健康雌性SD大鼠40只，4周齡，體質(zhì)量(90±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心，溫度(22±2)℃，相對濕度(70±2)%。動物實驗符合北京中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗藥物

歸術(shù)益坤方組成：菟絲子15 g、白術(shù)12 g、當歸10 g、北沙參10 g、生麥芽10 g、茜草6 g、浙貝母15 g、蛇床子3 g。飲片購于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院草藥房。購買原藥50劑，所有原藥加10倍量水煎煮，共煎2次，每次1小時，合并濾液后濃縮，60℃減壓干燥后得浸膏986 g(得膏率27.7%)，分瓶灌裝密封后4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。炔雌醇環(huán)丙孕酮片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：20190630)購自北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院西藥房。

1.3 主要試劑與儀器

丙酸睪酮注射液(寧波第二激素廠，批號20180624)，性激素Elisa試劑盒(Solarbio公司，批號20191123)，蛋白提取液(MDL公司，貨號MDL91201)，蛋白酶抑制劑(MDL公司，貨號MD912893)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(MDL公司，貨號MD913053)，SDS-PAGE預制膠套裝試劑盒(MDL公司，貨號MD911919)，蛋白上樣緩沖液(MDL公司，貨號MD6619)，封閉液(MDL公司，貨號MD912056)，麗春紅蛋白染液(MDL公司，貨號MD6622)，抗肌動蛋白抗體(Anti-Actin)(MDL公司，貨號MD6553)，兔抗PPAR-γ抗體(abcam公司，貨號ab209350)，兔抗PPARα抗體(abcam公司，貨號ab245209)，兔抗FOXO1抗體(Cell Singaling公司，貨號2880S)，兔抗FOXO3a抗體(Cell Singaling公司，貨號2497S)，兔抗SIRT1抗體(Cell Singaling公司，貨號9475S)，羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物，批號20190731)。

電子天平(德國Sartorius公司，型號Cubis?MSA224S-000-DA)，脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，型號TS-100)，旋渦混勻器(海門麒麟醫(yī)用儀器廠，型號XW-80A)，電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號BG-subMIDI)，低溫離心機(德國Sigma公司，型號3-30K)，SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司，型號Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司，型號GelDoc-It310)，ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司，型號170-8280)。

1.4 高雄激素PCOS大鼠模型建立

4周齡雌性SD大鼠40只，隨機取8只為空白組，喂食普通飼料；剩余32只給予高脂飼料。喂養(yǎng)的第4周起將32只高脂飼料飼養(yǎng)大鼠按1 mg/100 g肌注丙酸睪酮注射液(2 mL∶25 mg)，連續(xù)肌注14天。每日陰道涂片并濕片觀察陰道脫落細胞形態(tài)變化，每3日測量大鼠的體重并記錄。

造模成功標準：(1)動情周期消失；(2)大鼠卵巢組織形態(tài)學變化：肉眼觀察大鼠卵巢顏色蒼白，長徑增長，體積增大，卵巢表面可見數(shù)量較多透明囊泡。蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色光鏡下觀察卵巢出現(xiàn)數(shù)目較多的囊狀擴張卵泡，卵泡內(nèi)結(jié)構(gòu)不完整，顆粒細胞層數(shù)為1～2層或消失，不見放射冠和卵母細胞；(3)血清睪酮超過正常值；(4)模型組大鼠體重高于空白組20%以上。

實際造模過程中無大鼠死亡，全部40只大鼠均進入分組給藥環(huán)節(jié)。

1.5 分組及給藥

造模期間以普通飼料喂養(yǎng)，未肌注丙酸睪酮的8只大鼠為空白組。將32只造模大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、陽性對照組，每組8只。

中藥高劑量組按人鼠1∶8比例給予歸術(shù)益坤方浸膏(1.8 g/100 g)，中藥低劑量組按人鼠1∶4比例給予歸術(shù)益坤方浸膏(0.9 g/100 g)，陽性對照組按人鼠等效比例給予炔雌醇環(huán)丙孕酮片溶液(0.03 mg/kg)。各組每日給藥量均用生理鹽水稀釋至2 mL，模型組及空白組給予每日2 mL生理鹽水灌胃。每日固定15∶00灌胃，給藥時間3周。

1.6 取材與指標觀察

各組于末次給藥后禁食12小時，水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定，腹主動脈采血處死，血液注入生化(紅)采血管中，離心后取上層血清保存于-80℃冰箱待測。下延切口，暴露子宮及雙側(cè)輸卵管、卵巢，眼科剪取下雙側(cè)卵巢組織，分離清除表面輸卵管及脂肪組織，稱重，游標卡尺測量雙側(cè)卵巢長、寬、厚，左側(cè)卵巢置于10%甲醛中固定，右側(cè)卵巢凍存于液氮中備用。

1.6.1 卵巢形態(tài)學變化 (1)卵巢大體形態(tài)學比較：觀察卵巢形態(tài)學變化、稱重，計算橢圓形卵巢體積[體積(mm3)=0.52×長×寬×厚]。分別計算雙側(cè)卵巢體積后取平均值記錄。(2)卵巢的相對質(zhì)量(mg/100 g體質(zhì)量)：根據(jù)大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量計算卵巢相對質(zhì)量(臟器指數(shù))，即卵巢質(zhì)量∕(體質(zhì)量×10-2)。計算雙側(cè)卵巢的相對質(zhì)量后取平均值記錄。

1.6.2 ELISA法檢測血清性激素(LH、FSH、睪酮)水平變化 參考ELISA試劑盒操作流程：以標準物濃度、OD值為橫縱坐標，計算出標準曲線、回歸方程，計算樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)后即可得實際樣品濃度。

1.6.3 Western Blot法檢測各組大鼠卵巢組織中SIRT1、PPAR-α、PPAR-γ、FOXO1、FOXO3蛋白相對表達 卵巢組織研磨勻漿后提取總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為5 mg/mL。制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳。濕轉(zhuǎn)法65V轉(zhuǎn)膜2小時至PVDF膜上，置封閉液中封閉1小時。加入不同的一抗孵育：兔抗SIRT1抗體(1∶1 000)、兔抗PPAR-α抗體(1∶500)、兔抗PPAR-γ抗體(1∶500)、兔抗FOXO1抗體(1∶1 000)、兔抗FOXO3抗體(1∶1 000)。TBST緩沖液室溫下緩慢搖動洗滌三次，每次10分鐘。羊抗兔IgG二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫、避光緩慢搖動作用1小時。洗膜后用ECL發(fā)光試劑盒顯色，化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。Image J軟件數(shù)字化分析。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內(nèi)參(GAPDH)灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組PCOS大鼠卵巢體積變化

與空白組相比，模型組大鼠的卵巢體積顯著增大(P<0.01)，表明高雄激素PCOS大鼠模型建立成功。與模型組相比，陽性對照組、中藥高、低劑量組大鼠卵巢體積均顯著減小(P<0.01)。其中，中藥高劑量組卵巢體積顯著小于陽性對照組(P<0.05)和中藥低劑量組(P<0.05)，而陽性對照組卵巢體積顯著低于中藥低劑量組(P<0.05)。上述結(jié)果說明，中藥歸術(shù)益坤方和炔雌醇環(huán)丙孕酮片對PCOS大鼠模型均有治療作用，可顯著降低卵巢體積，并且高劑量歸術(shù)益坤方(1.8 g/100 g)效果顯著優(yōu)于炔雌醇環(huán)丙孕酮片。見表1。

表1 各組PCOS大鼠單個卵巢體積比較

2.2 各組PCOS大鼠卵巢相對質(zhì)量變化

造模后，模型組大鼠的卵巢相對質(zhì)量顯著增大(P<0.01)。較之模型組，陽性對照組、中藥高、低劑量組大鼠卵巢相對質(zhì)量均減少(P<0.01)。其中，陽性對照組和中藥高劑量組的卵巢相對質(zhì)量均小于中藥低劑量組(P<0.05)，而陽性對照組與中藥高劑量組間無明顯差異(P>0.05)。上述結(jié)果說明，中藥歸術(shù)益坤方和炔雌醇環(huán)丙孕酮片均可顯著降低PCOS大鼠模型的卵巢相對質(zhì)量，且歸術(shù)益坤方的治療效果與劑量有關(guān)。見表2。

表2 各組PCOS大鼠卵巢相對質(zhì)量比較

2.3 各組PCOS大鼠血清LH、FSH比較

造模后，模型組大鼠血清LH/FSH比值明顯上升(P<0.01)，陽性對照組、中藥高、低劑量組血清LH/FSH比值均有降低(P<0.05)。其中，中藥高劑量組與陽性對照組比較無明顯差異(P>0.05)，中藥高劑量組與中藥低劑量組比較無明顯差異(P>0.05)，但陽性對照組LH/FSH比值低于中藥低劑量組(P<0.05)。上述結(jié)果說明，中西藥物均對改善PCOS大鼠血清LH/FSH比值有效，但差異不明顯，炔雌醇環(huán)丙孕酮片的治療效果優(yōu)于低劑量中藥。見表3。

表3 各組PCOS大鼠血清LH/FSH比較

2.4 各組PCOS大鼠血清睪酮比較

造模后，模型組大鼠血清睪酮水平明顯上升(P<0.01)，各治療組血清睪酮水平較模型組均有改善(P<0.05)。其中，陽性對照組血清睪酮濃度顯著低于中藥高、低劑量組(均P<0.05)，中藥高劑量組與低劑量組療效比較無明顯差異(P>0.05)。這提示，炔雌醇環(huán)丙孕酮片對于改善高雄激素血癥的治療效果優(yōu)于中藥歸術(shù)益坤方。見表4。

表4 各組PCOS大鼠血清睪酮比較

2.5各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關(guān)蛋白表達情況

造模后，模型組大鼠卵巢內(nèi)SIRT-FOXO信號通路相關(guān)蛋白SIRT1、FOXO1、FOXO3、PPAR-α、 PPAR-γ表達均升高(P<0.01)。 與模型組比較，中藥高、 低劑量組上述蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，且中藥高劑量組SIRT1、FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白的降低顯著優(yōu)于中藥低劑量組。與模型組比較，陽性對照組FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，但SIRT1、PPAR-γ蛋白表達水平升高(P<0.05)。炔雌醇環(huán)丙孕酮對SIRT1、FOXO1、FOXO3的治療效果優(yōu)于低劑量中藥(P<0.05)，弱于高劑量中藥(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關(guān)蛋白表達情況比較

圖1 各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

PCOS發(fā)生的主要病因是臟腑功能失調(diào)引起腎—天癸—沖任—胞宮軸調(diào)節(jié)紊亂，其中脾腎兩虛是發(fā)病根本，肝郁是重要環(huán)節(jié)，痰濕、瘀血內(nèi)阻為主要的病理機制，病性屬本虛標實，多從腎、脾、肝論治[4]。柴嵩巖國醫(yī)大師致力于本病研究70余年，歸納出本病“二陽致病”理論[6]，并依據(jù)此理論自擬歸術(shù)益坤方。全方以菟絲子、白術(shù)為君，菟絲子補肝腎，益精髓，白術(shù)味苦甘，有補氣健脾、燥濕利水、止汗安胎的功效；當歸為臣藥，既可活血，又可補血，補中有動，行中有補；另以益母草等藥為佐使。歸術(shù)益坤方全方共奏補腎健脾、養(yǎng)血通利之功，獨創(chuàng)從肺、脾、腎三臟共同論治之法，達到標本兼治之效。

本研究團隊前期研究已證實，歸術(shù)益坤方可顯著上調(diào)P53基因的表達，下調(diào)AMPK基因的表達，通過調(diào)控P53/AMPK通路影響卵巢顆粒細胞自噬，從而干預PCOS發(fā)病，這為中藥干預PCOS的機制研究提供了新依據(jù)[5]。

本研究目標在于SIRT1-FOXO通路。SIRT1作為一種去乙酰化酶，主要影響多種蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)下游因子和蛋白表達水平，并可通過多種機制調(diào)控細胞凋亡，影響疾病發(fā)生[7]。SIRT1可與多種底物相互作用，通過去乙?；问絽⑴c調(diào)控細胞凋亡、DNA損傷的修復、脂代謝等過程[3]。

PPAR-α、PPAR-γ是SIRT1的下游基因，其表達與SIRT1正相關(guān)，升高的PPAR水平可激活脂肪動員，調(diào)節(jié)脂類重新分布[8]，這提示SIRT1可通過PPAR通路影響脂肪累積，導致PCOS患者肥胖、性激素變化和胰島素抵抗等臨床癥狀[9]。氧化應激時，F(xiàn)OXO的乙?；鰪?，F(xiàn)OXO活化通路中下游靶因子的活性，發(fā)生細胞凋亡[10]。在棕色脂肪組織中，SIRT1抑制Smad3和ATF4進而減少應激引起的細胞凋亡[11]。

前期研究的P53基因亦可與SIRT1共同發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)FOXO家族多種蛋白活性，同時FOXO也可反向調(diào)控SIRT1的表達，發(fā)揮各自生理功能。FOXO家族在應激損傷，DNA修復和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。FOXO屬于叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子家族，在哺乳動物中包含F(xiàn)OXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6四個亞型，其中FOXO1最早被發(fā)現(xiàn)、研究[13]。而FOXO家族成員FOXO1已被證明在糖脂代謝、胰島素抵抗及氧化應激過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14-15]。FOXO1可通過增加血循環(huán)中葡萄糖水平來調(diào)節(jié)肝臟、胰腺、下丘腦—垂體軸和脂肪組織的循環(huán)代謝和激素分泌[16-17]，F(xiàn)OXO1在糖異生過程中作用于葡萄糖-6-磷酸酶等關(guān)鍵酶升高血糖水平，并通過胰島素影響胰島β細胞的凋亡和糖尿病的發(fā)展[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1的表達與PCOS患者體內(nèi)C反應蛋白、白介素和腫瘤壞死因子α等慢性炎癥因子呈正相關(guān)，后者通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌機制降低組織細胞對胰島素的敏感性，從而引起胰島素抵抗，導致PCOS發(fā)病[19-20]。

本研究在前期研究的基礎上，進一步聚焦歸術(shù)益坤方對SIRT1-FOXO通路的影響，以期進一步明確中藥治療PCOS的作用機制。結(jié)果顯示，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合丙酸睪酮造模后，模型組大鼠卵巢體積、卵巢相對質(zhì)量、血清LH/FSH比值、血清睪酮水平均有明顯提升，卵巢組織SIRT1-FOXO通路各相關(guān)蛋白表達均升高。經(jīng)歸術(shù)益坤方干預后，卵巢體積、質(zhì)量、血清學指標均有顯著改善，該通路相關(guān)蛋白表達也出現(xiàn)下調(diào)。其中部分結(jié)果中藥高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組，說明藥物劑量對療效存在影響。同時，陽性對照藥物炔雌醇環(huán)丙孕酮片對卵巢形態(tài)學、血清學指標均有改善，其中對血清LH/FSH比值、血清睪酮水平的療效明顯優(yōu)于歸術(shù)益坤方，且對FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白亦有下調(diào)作用。以上結(jié)果證明，歸術(shù)益坤方可調(diào)控SIRT1-FOXO通路上相關(guān)基因表達，減輕PCOS大鼠卵巢增大、血清學改變等癥狀。但炔雌醇環(huán)丙孕酮并未影響PPAR-α、SIRT1蛋白表達，卻能顯著改善激素水平，尤其是降低血清睪酮，這提示SIRT1仍有其他下游基因，且除本通路外仍有其他可能的途徑影響PCOS的發(fā)病，值得進一步探索。