抑郁模型小鼠海馬中膽汁酸受體變化的研究

吳 靜，李學義，陳京紅，王澤劍

1.上海交通大學藥學院，上海 200240；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心，上海 200030

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是神經精神疾病中最重要的疾病之一，也是一種基因與環(huán)境交互影響的異質性重大精神疾病，以顯著而持久的心境低落與興趣減少為主要臨床特征。目前現(xiàn)有臨床藥物對約30%MDD 患者的臨床療效欠佳。因此，抑郁癥仍需尋找新的治療靶點［1］。

女性MDD 發(fā)生率約為男性的2 倍，其高發(fā)年齡段分別為青春期、孕產期和絕經期；這3 個階段均與女性體內雌激素水平急劇改變有關。現(xiàn)代醫(yī)學認為：雌激素受體屬于核受體之一，高水平雌二醇可以干擾肝臟膽汁酸受體后信號造成肝內膽汁淤積［2］。清代葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中指出：“女子以肝為先天?！薄吨嗅t(yī)基礎理論》中藏象學說指出：肝“主疏泄，其性升發(fā)，喜條達惡抑郁，以舒暢全身氣機，調節(jié)情志”。由此可見，女性更容易受情緒影響出現(xiàn)“郁證”。傳統(tǒng)中醫(yī)認為：抑郁癥屬于“郁證”的范疇，其發(fā)生與肝郁氣滯或肝郁脾虛有關。因此，中醫(yī)常采用疏肝、利膽、健脾的方法如解郁丸、逍遙丸等治療［3-4］，臨床起效快，并有確切療效。膽汁酸在腸道主要通過其受體發(fā)揮抗炎、抑菌作用。?；切苋パ跄懰峥蓽p輕脂多糖誘發(fā)的小鼠抑郁樣行為及神經炎［5］；它可能是通過小膠質細胞膜上G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1，又稱為TGR5）發(fā)揮抗炎作用［6］。這些結果提示腦內同樣存在膽汁酸受體，但其功能尚不完全清楚。

下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸是哺乳動物的一個生物穩(wěn)態(tài)調節(jié)系統(tǒng)，在各種生理、病理性應激反應中發(fā)揮長期調節(jié)作用。HPA 軸功能障礙在抑郁癥和慢性疲勞綜合征等神經內分泌疾病中得到了廣泛的研究。有研究［7-8］表明，HPA軸功能異常在女性MDD 形成中作用更為顯著。C57BL/6 小鼠壓力應激誘導下產生的應激行為可以被糖皮質激素的拮抗劑所逆轉［9］。海馬是MDD 研究中常見的腦區(qū)之一。MDD 患者尸檢［10］發(fā)現(xiàn)：海馬CA1區(qū)體積減小，伴星形膠質細胞大量丟失和萎縮。本實驗采用在體動物實驗和離體細胞學研究相結合的方法，初步探索抑郁癥患者腦內海馬區(qū)膽汁酸受體變化及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 SPF 級C57BL/6 健康雌性小鼠，4 周齡，體質量15～17 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號為SCXK （滬）2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學動物實驗中心，環(huán)境溫度（22±3）℃、濕度40%～70%、12 h 明暗交替；實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2018-0028。實驗動物操作經上海交通大學動物倫理委員會批準，倫理批號為20181112。

大鼠膠質瘤細胞（C6）購于中國科學院上海細胞庫，細胞使用含有10%胎牛血清的F-12 培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑 TGR5 一抗購于英國Abcam 公司，甘油醛-3- 磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體購于美國Bioworld公司，β-肌動蛋白（β-actin） 抗體、法尼脂X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）一抗和腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）一抗購于美國Proteintech公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購于美國Jackson ImmunoResearch公司，地塞米松（dexamethasone，DEX）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，小鼠成纖維細胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15） ELISA 試劑盒、小鼠膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK） ELISA 試劑盒、大鼠BDNF ELISA 試劑盒和大鼠膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）ELISA 試劑盒購于上海榕珉生物（XLPCC）公司，RIPA 蛋白裂解液、BCA 檢測試劑盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將30 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，按照隨機分配方法分為3組，對照（control，CON）組、慢性不可知性應激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）組和DEX 組，每組10 只。DEX 組按每次2.0 mg/kg 的劑量給予DEX 灌胃，每日2 次（上午8 點和下午5 點）；CON 組和CUMS 組同樣每日灌胃2 次，給予等體積的溶劑（羧甲基纖維素鈉，CMC-Na）。造模時間5 周，每周固定時間稱取小鼠體質量。

1.2.2 CUMS 模型的建立 CUMS 組在每日灌胃處理之后給予不同刺激造模，持續(xù)5 周。刺激方法為晝夜顛倒、冰水游泳5 min、傾斜鼠籠45°、潮濕墊料、電擊鼠尾、束縛3 h、禁水禁食、噪聲刺激3 h。刺激方式每日隨機產生，同一種刺激方式不能連續(xù)出現(xiàn)。除部分CUMS 刺激周期內，小鼠其他時段均正常提供飲食。

1.2.3 行為學研究

（1） 強迫游泳實驗（forced swimming test，F(xiàn)ST） 將小鼠單獨放置在直徑14 cm、水深20 cm 的燒杯內，水溫22 ℃。游泳時長6 min，記錄小鼠后4 min內靜止不動的時間。每只小鼠結束實驗后，及時換水，避免對后面實驗小鼠產生影響。

（2） 懸尾實驗（tail suspension test，TST） 安靜環(huán)境下，將實驗小鼠尾部末端1/3處固定在實驗裝置上，倒置小鼠。實驗記錄6 min，記錄小鼠后4 min內靜止不動的時間。

（3） 糖水偏好實驗（sucrose preference test，SPT）小鼠首先進行糖水適應性實驗，待適應性實驗結束后小鼠正式進行SPT。禁水禁食24 h，24 h 后進行實驗，每只鼠籠放入2瓶100 mL的水，一瓶為1%蔗糖溶液，一瓶為純凈水。12 h 后調換2 瓶水的位置，24 h 后結束實驗，記錄糖水和純水消耗量。計算糖水消耗百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+純凈水消耗量）×100%。

1.2.4 ELISA 檢測血清中FGF15 和CCK 含量 小鼠完成行為學實驗之后進行眼球取血，血液于4 ℃靜置2 h，5 300×g離心15 min，收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂眯∈驠GF15 和CCK ELISA 試劑盒，按說明書進行檢測，于波長450 nm 處測定吸光度（D），繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線獲得樣品濃度。

1.2.5 小鼠臟器質量及組織分離 實驗結束后，稱取小鼠體質量，頸椎脫臼處死，分別取出腦、心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胸腺及膽囊，用吸水紙吸干不同臟器表面血跡及體液，置于電子天平上（精度為0.000 1 g），稱取各臟器質量，比較各組臟器系數(shù)差異，臟器系數(shù)=臟器質量/小鼠體質量。腦組織稱重結束后，在冰上迅速分離兩側海馬組織，并立即置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.6 Western blotting 檢測小鼠海馬組織及C6 細胞中相關蛋白水平變化 從-80 ℃冰箱取出海馬組織，加入RIPA 蛋白裂解液，使用勻漿機在冰上裂解30 min，于4 ℃，12 000×g離心10 min 取上清液。C6 細胞使用25、50、100、200 和400 μmol/L DEX 處理3 d 后，去除培養(yǎng)基，使用RIPA 蛋白裂解液裂解后，于4 ℃，12 000×g離心10 min 取上清液。利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)不同蛋白的相對分子質量選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠。隨后進行蛋白變性、上樣、電泳、轉膜和封閉，一抗4 ℃孵育過夜，次日洗膜，加入二抗孵育，最后用ECL發(fā)光液曝光、顯影，以GAPDH或β-actin作為內參，以目的蛋白和內參的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 ELISA 檢測C6 細胞培養(yǎng)基中GDNF 和BDNF 含量 C6 細胞使用不同劑量DEX 處理3 d 后，收集細胞培養(yǎng)基，使用大鼠BDNF 和GDNF ELISA 試劑盒檢測細胞培養(yǎng)基中BDNF和GDNF的含量。

1.2.8 細胞內ROS 含量檢測 C6 細胞使用DEX 200 μmol/L 進行處理，處理3 d 后，去除細胞培養(yǎng)基，使用胰酶消化，收集細胞；每管加入100 μL濃度為10 mol/L的DCFH-DA 熒光探針，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min，孵育結束后，使用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，去除多余的熒光探針；隨后每管加入200 μL 無血清培養(yǎng)基，使用熒光檢測儀檢測熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm；同時使用細胞計數(shù)儀對細胞進行計數(shù)，以熒光強度/細胞數(shù)代表細胞內ROS含量。

1.2.9 N-乙酰-L-半胱氨酸處理C6 細胞 C6 細胞先加入5 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）處理2 h，然后加入200 μmol/L DEX 孵育3 d，提取細胞內蛋白，使用Western blotting 檢測細胞內蛋白水平變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用軟件GraphPad Prism7.0 和SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。定量資料用±s表示，滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗或單因素方差分析檢驗或雙因素方差分析檢驗，進一步組間兩兩比較使用Student-Newman-Keuls 檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis 秩和檢驗）進行事后分析。

2 結果

2.1 小鼠體質量

建模完成后發(fā)現(xiàn)各組小鼠體質量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖1）：與CON 組比較，CUMS 組的體質量顯著下降（P<0.05），DEX 組小鼠的體質量與CON 組相比顯著上升（P<0.05）。

圖1 小鼠建模過程中體質量動態(tài)變化趨勢Fig 1 Dynamic change trend of body mass in mice during modeling

2.2 行為學指標

2.2.1 FST 建模后各組小鼠不動時間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2A）：與CON 組相比，CUMS 組和DEX組不動時間均顯著延長。

2.2.2 TST 建模后各組小鼠不動時間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2B）：與CON 組相比，CUMS 組和DEX組不動時間均顯著延長。

2.2.3 SPT 建模后各組小鼠糖水消耗百分比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2C）：與CON 相比，CUMS 組和DEX組糖水消耗百分比均降低。

圖2 小鼠建模完成后行為學指標變化Fig 2 Behavioral changes after mice modeling

2.3 小鼠臟器系數(shù)比較

對各臟器系數(shù)進行組間比較發(fā)現(xiàn)，各組小鼠膽囊系數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）：與CON 組相比，CUMS組和DEX組膽囊系數(shù)均顯著上升（圖3A）。

2.4 外周血中FGF15和CCK的含量

ELISA 結果顯示，F(xiàn)GF15 在DEX 組和CUMS 組中呈相反趨勢，CUMS組較CON組顯著下降（P<0.05），DEX組則顯著上升（P<0.05）；CCK 含量在CUMS組中顯著上升（P<0.01），DEX 組與CON 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3B、C）。

圖3 各組小鼠膽囊系數(shù)及血清中FGF15和CCK的含量Fig 3 Gallbladder organ coefficient and serum levels of FGF-15 and CCK in each group

2.5 海馬中BDNF、TGR5、FXR蛋白的表達水平

各組小鼠海馬組織中BDNF 蛋白表達水平差異不具有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)XR和TGR5蛋白表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與CON 組相比，CUMS 組和DEX組FXR蛋白表達水平顯著上升，TGR5蛋白表達水平顯著下降（均P<0.05）（圖4）。

圖4 小鼠建模后海馬內相關蛋白水平的變化Fig4 Changes in related protein levels in mouse hippocampus after modeling

2.6 C6細胞中FXR、TGR5蛋白的表達水平

為研究HPA 軸功能異常對星形膠質細胞功能影響，我們采用膠質細胞系C6細胞建立體外模型。C6細胞使用25、50、100、200 和400 μmol/L DEX 孵育3 d 后，200 μmol/L 和400 μmol/L DEX 組與對照組相比，F(xiàn)XR 蛋白表達水平顯著升高（均P<0.05），TGR5 蛋白表達水平顯著下降（均P<0.05，圖5）。

圖5 C6細胞使用DEX處理后相關蛋白水平的變化Fig 5 Changes in related protein levels in C6 cells treated with DEX

2.7 C6細胞分泌神經營養(yǎng)因子的水平

C6細胞使用25、50、100、200和400 μmol/L的DEX孵育3 d 后，400 μmol/L 組與對照組相比，BDNF 含量在培養(yǎng)基中顯著下降（P<0.05，圖6A），50、100、200 和400 μmol/L 組與對照組相比GDNF 含量顯著下降（均P<0.05，圖6B）。鑒于該結果，后續(xù)研究采用200 μmol/L DEX作為體外模型的造模劑量。

圖6 C6細胞使用DEX處理后培養(yǎng)基中神經營養(yǎng)因子的含量變化Fig 6 Changes of BDNF and GDNF concentrations in the cell culture medium in C6 cells treated with DEX

2.8 C6細胞內的ROS水平

C6細胞在使用200 μmol/L的DEX孵育3 d后，與對照組相比，熒光強度顯著增強，ROS水平顯著升高；經量化檢測，200 μmol/L DEX組的熒光強度約是對照組的4倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此可見，C6 細胞經200 μmol/L DEX孵育后，ROS水平顯著升高（圖7）。

圖7 C6細胞加入DEX孵育3 d后細胞內ROS水平的變化Fig7 Change of ROS level in the C6 cells treated with DEX for 3 d

2.9 NAC對DEX造成C6細胞FXR和TGR5改變的影響

在200 μmol/L DEX 處理前，加入5 mmol/L NAC 預處理2 h，Western blotting 檢測細胞內FXR 和TGR5 表達水平。由圖8 可以看出，DEX+NAC 組C6 細胞內FXR 含量較DEX 組顯著降低（P<0.05）；TGR5 含量略上升（P>0.05），但差異無統(tǒng)計學意義。

圖8 NAC預處理2 h對DEX處理3 d的C6細胞內FEX和TGR5表達變化的影響Fig 8 Effect of NAC pretreatment for 2 h on the expression of FEX and TGR5 in the C6 cells treated with DEX for 3 d

3 討論

目前MDD 動物造模方法有皮質類固醇喂養(yǎng)、CUMS以及獲得性無助等。由于青春期是女性MDD 的高發(fā)年齡段［11］，因此本研究采用4周齡雌性小鼠用于本次試驗。

CUMS 模型是目前經典動物抑郁模型，具有與MDD相似的一系列神經生物學效應，包括HPA 軸異常、海馬神經再生障礙、神經遞質水平改變等［12-13］；但由于各實驗室CUMS 應激順序和方式不同，其糖水偏好實驗往往重復性較差［14］。另外，高水平皮質類固醇激素長期暴露可模擬慢性應激［15］，其HPA 軸的功能障礙與MDD 患者相似，伴隨快感消失；且由于類固醇激素可以精確定量，其在快感缺失的糖水偏好實驗中重復性較好。本研究利用2種雌性抑郁動物模型，探索抑郁行為與外周膽汁酸受體后信號和中樞膽汁酸相關受體變化的關系。

與CON 組相比，2 種雌性動物模型均顯示出了明顯的快感消失、懸尾及游泳不動時間延長，提示2種抑郁動物模型成功。動物解剖過程中發(fā)現(xiàn)抑郁模型動物膽囊體積增大，與CON 組相比膽囊系數(shù)差異有統(tǒng)計學意義。為此，我們檢測了外周血清中FGF15 和CCK。膽汁酸激活小腸上皮細胞內FXR 后，可產生FGF15，負反饋性抑制肝臟膽酸從頭合成途徑。

肝臟細胞內FXR 激活后可促進肝臟膽酸排泄，抑制膽酸腸肝循環(huán)。以往文獻顯示：DEX 低劑量可促進膽汁酸轉運和排出，高劑量可通過非FXR 依賴方式抑制膽汁酸合成及轉運調控作用［16-17］，因此DEX 可用于治療膽汁淤積性肝炎。與CON 組相比，DEX 組血清FGF15 含量顯著增加，伴隨有CCK 下降趨勢，提示DEX 促進膽汁酸轉運入盲腸，刺激腸道FXR/FGF15 通路，抑制肝臟膽汁酸從頭合成途徑；由于CCK 水平的降低，膽囊收縮能力下降，可能與本研究中膽囊系數(shù)增加有關。與CON 組相比，CUMS 組血清FGF15 含量顯著減少（提示肝臟分泌進入腸道的膽汁酸含量減少），CUMS 組CCK 顯著增加；雖然CCK 可收縮膽囊，但高水平的CCK 也可抑制胃腸道蠕動，造成動物食量下降，體質量減輕，其結果符合中醫(yī)“肝失疏泄，橫逆犯胃，胃失和降”的描述。因此，2組不同抑郁模型可能與外周原發(fā)性和繼發(fā)性的膽汁酸代謝異常有關，但外周膽汁酸代謝異常如何引起中樞神經系統(tǒng)改變還需進一步研究。

與CON 組相比，雌性抑郁小鼠海馬區(qū)TGR5 蛋白顯著減少，伴隨FXR顯著增加。TGR5是膽汁酸的細胞膜受體，膽汁酸激動外周TGR5/胰高血糖素樣肽-1（glucagonlike peptide 1，GLP-1）途徑，在調節(jié)糖脂代謝、膽汁代謝以及抑制核轉錄因子κb（nuclear factor-κb，NF-κb）激活中發(fā)揮重要作用［18］；TGR5 在腦卒中動物模型中顯示出神經保護作用［6］，而在肝性腦病動物模型的神經膠質細胞中的表達量顯著減少［19］，為此我們認為抑郁動物模型海馬區(qū)TGR5 表達減少可能增強了MDD 模型中海馬對慢性應激造成損傷的敏感性。腦內通過慢病毒高表達FXR 蛋白可誘導大鼠產生顯著抑郁行為伴隨腦內BDNF蛋白量降低［20］，而敲除腦內FXR可阻斷CUMS 對大鼠行為學和BDNF的影響；我們首次在2種不同抑郁動物模型中顯示腦內海馬區(qū)膽汁酸膜受體減少，伴隨膽汁酸核受體增加。此外，我們發(fā)現(xiàn)雌性嚙齒類動物造模后腦內海馬區(qū)BDNF 表達水平未出現(xiàn)明顯降低，該結果與以往報道［21］相似，CUMS 造成的海馬區(qū)BDNF 表達水平降低更容易出現(xiàn)在雄性嚙齒類動物中，可能與雌性動物青春期高雌激素水平造成的腦保護作用有關。

我們使用DEX 處理C6 細胞研究HPA 軸功能紊亂對腦內星形膠質細胞的影響。實驗發(fā)現(xiàn)200 μmol/L 和400 μmol/L DEX 可增加FXR、減少TGR5 的蛋白水平。以往文獻顯示：FXR 高表達可加重淀粉樣蛋白觸發(fā)的神經細胞凋亡，敲減FXR可以翻轉淀粉樣蛋白觸發(fā)的神經細胞凋亡［22］。本研究證實高劑量DEX 可同時造成星型膠質細胞內TGR5 蛋白水平的降低和FXR 蛋白水平的增高，伴隨細胞內ROS 水平激增，以及BDNF 和GDNF 顯著下降，使用抗氧化劑NAC 可顯著逆轉FXR 蛋白水平，提示DEX 造成的氧化應激在星型膠質細胞膽汁酸受體異常改變中發(fā)揮重要作用。我們推測DEX 造成氧化應激水平升高與膽汁酸受體表達異常有關。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)DEX和CUMS小鼠抑郁模型中小鼠海馬區(qū)膽汁酸受體表達改變，該效應可能與HPA軸功能異常造成的星形膠質細胞內高氧化狀態(tài)有關，NAC可部分逆轉DEX造成的星形膠質細胞模型的膽汁酸受體異常。氧化應激造成星形膠質細胞膽汁酸受體改變的具體機制及抗氧化劑是否能夠改善小鼠抑郁行為仍有待進一步探索。