微小RNA-588靶向調(diào)控脾酪氨酸激酶的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用

張霓，伍文才，李春燕，陳欣

胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著在分子水平上對(duì)胃癌的發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制的研究的不斷深入，眾多分子靶向藥物的出現(xiàn)對(duì)晚期胃癌的治療提供了良好的前景[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及藥物敏感性等[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-588高表達(dá)能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]；miR-588在肺鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，與腫瘤分期和淋巴結(jié)侵襲呈負(fù)相關(guān)，miR-588過表達(dá)通過靶向GRN可抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲[5]。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要的作用，Syk在胰腺癌組織中低表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6]；Syk可抑制胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)胃癌腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。miR-588和Syk均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但miR-588與Syk之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚，而且miR-588對(duì)胃癌增殖、凋亡的影響及可能的作用機(jī)制也不清楚，本研究自2019年1―5月研究miR-588對(duì)胃癌增殖、凋亡的影響以及用TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)miR-588是否與Syk存在靶向調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1均購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京Solarbio公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；取胃癌細(xì)胞BGC-823和MGC-803，將miR-NC、miR-588、anti-miR-NC和antimiR-588分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞BGC-823和MGC-803中，記為miR-NC組、miR-588組、anti-miR-NC組和antimiR-588組；將anti-miR-588分別與si-NC和si-Syk共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞BGC-823和MGC-803中，記為antimiR-588+si-NC組和anti-miR-588+si-Syk組，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于實(shí)驗(yàn)，采取的是瞬時(shí)表達(dá)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）檢測(cè)miR-588表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按熒光定量試劑盒說明操作，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量用2?ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜；加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，按試劑盒說明操作，加入Annexin VFITC和PI，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建Syk野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體（WT-Syk和MUT-Syk），將其分別與miR-NC和miR-588共轉(zhuǎn)染至BGC-823、MGC-803細(xì)胞，依據(jù)說明書要求檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-588在細(xì)胞 SGC-7901、BGC-823、MGC-803和GES-1中的表達(dá)胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803中miR-588的表達(dá)水平高于GES-1細(xì)胞[（0.58±0.06）、（0.84±0.08）、（0.97±0.10）比（0.36±0.04），F(xiàn)=89.59，P<0.05]?？梢?，在胃癌株中miR-588高表達(dá)。

2.2 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823、MGC-803增殖的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-588組細(xì)胞BGC-823、MGC-803中miR-588表達(dá)水平降低，cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，P21蛋白表達(dá)水平升高，胃癌細(xì)胞活性降低（P<0.05）（圖1，表1、2）?？梢?，抑制miR-588表達(dá)抑制細(xì)胞BGC-823、MGC-803的增殖。

圖1 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823、MGC-803增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823增殖的影響/±s

表1 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823增殖的影響/±s

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。

組別細(xì)胞活性（OD490 nm）72 h重復(fù)次數(shù)miR-588 cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值1.31±0.13 0.62±0.06 11.81 0.000 6 0 60.83±0.08.42±0.04 11.23 0.000 0.81±0.08 0.22±0.02 17.53 0.000 0.32±0.03 0.93±0.09 15.75 0.000 0.52±0.05 0.37±0.03 6.30 0.000 0.94±0.09 0.49±0.05 1.04 0.323

表2 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803增殖的影響/±s

表2 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803增殖的影響/±s

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值細(xì)胞活性（OD490 nm）72 h 1.31±0.13 0.57±0.06 12.66 0.000重復(fù)次數(shù)6 6 miR-588 0.96±0.10 0.35±0.03 14.31 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.15±0.01 20.05 0.000 P21蛋白0.32±0.03 1.06±0.10 17.36 0.000 24 h 0.52±0.05 0.31±0.03 8.82 0.000 48 h 0.94±0.09 0.42±0.04 12.93 0.000

2.3 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823、MGC-803凋亡的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-588組胃癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）（圖2，表3，表4）?？梢?，抑制miR-588表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞BGC-823、MGC-803凋亡。

圖2 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823凋亡蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823凋亡的影響/±s

表3 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關(guān)X，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2。

Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02 17.83 0.000 6 6組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36 16.87 0.000重復(fù)次數(shù)Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08 16.93 0.000

表4 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803凋亡的影響/±s

表4 抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關(guān)X，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76 15.85 0.000重復(fù)次數(shù)6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01 21.82 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09 18.33 0.000

2.4 miR-588靶向、調(diào)控Syk 將Syk用TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)其可能的作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示Syk與miR-588存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。miR-588與WT-Syk共轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）（表5）。Western Blot檢測(cè)結(jié)果（圖3B，表6）顯示，miR-588組BGC-823、MGC-803中Syk蛋白的表達(dá)水平顯著miR-NC組；anti-miR-588組胃癌細(xì)胞BGC-823、、MGC-803中Syk蛋白的表達(dá)水平顯著高于 anti-miR-NC組（P<0.05）?？梢姡琺iR-588可靶向調(diào)控Syk的表達(dá)。

圖3 miR-588靶向調(diào)控Syk：A為Syk與miR-588的互補(bǔ)序列；B為miR-588調(diào)控Syk的表達(dá)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶。

重復(fù)次數(shù)組別MUT-Syk WT-Syk miR-NC miR-588 t值P值6 6 0.99±0.09 1.01±0.10 0.36 0.723 0.96±0.09 0.47±0.04 12.19 0.000

表6 miR-588調(diào)控Syk的表達(dá)/±s

表6 miR-588調(diào)控Syk的表達(dá)/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-NC組比較，P<0.05。

MGC-803 Syk蛋白0.15±0.01 0.03±0.01①0.17±0.01 0.62±0.06②413.28 0.000組別miR-NC miR-588 anti-miR-NC anti-miR-588 F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 BGC-823 Syk蛋白0.16±0.01 0.05±0.01①0.15±0.01 0.48±0.05②298.86 0.000

2.5 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用與antimiR-588+si-NC組相比，anti-miR-588+si-Syk組胃癌細(xì)胞BGC-823和MGC-803中cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，P21、Bax、Syk蛋白的表達(dá)水平顯著降低，胃癌細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）（圖4，表7～10）?？梢?，抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用。

圖4 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823、MGC-803增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表7 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用/±s

表7 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值72 h 1.31±0.13 0.62±0.06①0.61±0.06 0.98±0.09②83.33 0.000214重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 Syk蛋白0.13±0.01 0.46±0.04①0.48±0.04 0.29±0.03②153.52 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.22±0.02①0.21±0.03 0.54±0.05②194.59 0.000 P21蛋白0.32±0.03 0.93±0.09①0.91±0.09 0.65±0.06②94.25 0.000細(xì)胞活性（OD490 nm）24 h 0.52±0.05 0.37±0.03①0.35±0.03 0.45±0.04②24.78 0.000 48 h 0.94±0.09 0.49±0.05①0.47±0.05 0.69±0.07②63.86 0.000

表8 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803增殖的抑制作用/±s

表8 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803增殖的抑制作用/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

組別細(xì)胞活性（OD490 nm）重復(fù)次數(shù)72 h Syk蛋白cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值1.31±0.13 0.57±0.06①0.59±0.06 1.03±0.10②90.91 0.000 6 6 6 6 0.13±0.01 0.58±0.06①0.60±0.06 0.28±0.03②155.78 0.000 0.81±0.08 0.15±0.01①0.13±0.01 0.64±0.06②279.90 0.000 0.32±0.03 1.06±0.10①1.04±0.10 0.55±0.05②138.42 0.000 0.52±0.05 0.31±0.03①0.30±0.03 0.46±0.04②48.92 0.000 0.94±0.09 0.42±0.04①0.43±0.04 0.73±0.07②93.93 0.000

表9 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823凋亡的促進(jìn)作用/±s

表9 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823凋亡的促進(jìn)作用/±s

注：①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08①0.81±0.08 0.56±0.06②101.57 0.000組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02①0.21±0.02 0.47±0.04②214.00 0.000凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36①24.86±2.37 14.58±1.23②127.18 0.000

表10 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803凋亡的促進(jìn)作用/±s

表10 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞MGC-803凋亡的促進(jìn)作用/±s

注：Bax為Bcl相關(guān)X，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76①26.36±2.47 12.58±1.26②137.57 0.000組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01①0.14±0.01 0.58±0.06②276.67 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09①0.94±0.09 0.41±0.04②168.53 0.000

3 討論

胃癌的發(fā)病率和死亡率較高，手術(shù)結(jié)合放化療仍是其治療的主要方法，但化療藥物的不良反應(yīng)和耐藥性導(dǎo)致患者治療及預(yù)后不佳，特定分子靶向藥物具有不良反應(yīng)少、耐藥率低等優(yōu)點(diǎn)成為治療晚期胃癌的新手段[8]。大量研究表明miRNAs在胃癌中的異常表達(dá)與胃癌的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，可作為胃癌早期診斷、預(yù)后的標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)[9]。miR-588在人前列腺癌中上調(diào)表達(dá)，與患者預(yù)后和存活率密切相關(guān)，miR-588下調(diào)表達(dá)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[10]。而miR-588在乳腺癌中下調(diào)表達(dá)，miR-588上調(diào)表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，增加順鉑化學(xué)敏感性[11]。miR-588還參與調(diào)控乳腺癌的PTX耐藥性[12]。王金申利用miRNA芯片技術(shù)篩選出在胃癌中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-588在胃癌中上調(diào)表達(dá)[13]。本研究結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞中miR-588高表達(dá)，抑制miR-588表達(dá)促進(jìn)P21、Bax蛋白的表達(dá)，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)；還可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Syk是一種潛在的抑癌基因，Syk基因啟動(dòng)子超甲基化是其沉默的機(jī)制之一，Syk的低表達(dá)與腫瘤增生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白通過逆轉(zhuǎn)Syk基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化，可抑制喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖、侵襲遷移[15]；Syk抑制劑可減弱血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[16]。在胃癌細(xì)胞中Syk低表達(dá)，高表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)胃癌組織腫瘤細(xì)胞凋亡[17]；蘆丁聯(lián)合奧沙利鉑通過激活FKN/SYK/p38通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[18]。此外，Syk還可通過被miRNA調(diào)控影響腫瘤的進(jìn)展，如Syk是miR-146a的直接靶標(biāo)，且影響急性髓性白血病小鼠的存活[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-588可負(fù)調(diào)控Syk表達(dá)。

cyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，cyclinD1高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而p21是一種新的抑癌基因，高表達(dá)抑制細(xì)胞增殖[20-21]。Bax和Bcl-2是凋亡相關(guān)蛋白，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抗凋亡因子[22]。抑制miR-588表達(dá)促進(jìn)P21、Bax蛋白的表達(dá)，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)；說明抑制miR-588表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而同時(shí)抑制Syk和miR-588的表達(dá)可以促進(jìn)cyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制p21、Bax的表達(dá)，說明抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-588對(duì)細(xì)胞BGC-823的作用。進(jìn)一步說明，miR-588可以調(diào)控Syk表達(dá)，且miR-588調(diào)控Syk進(jìn)而通過調(diào)控增殖及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-588能抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Syk有關(guān)。