長鏈非編碼RNA NR2F1-AS1靶向微小RNA-145-5p調控結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制

趙剛，武青生，趙延禮，馬生彪，王巍，穆元忠

結腸癌是常見的惡性腫瘤，表現(xiàn)為細胞增殖失控，腫瘤復發(fā)和轉移是導致其治療失敗的主要原因[1]。目前，結腸癌的病因和發(fā)病分子機制尚未完全清楚，探討影響結腸癌細胞惡性行為的分子機制對于闡明結腸癌發(fā)病機制的及尋找治療靶點意義重大。長鏈非編碼RNA（lnc RNA）參與腫瘤細胞生物學行為調控的長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其表達失調與腫瘤進展關系密切[2-3]。lncRNA NR2F1-AS1是核受體亞族2F組成員1（nuclear receptor subfamily 2 group F member 1，NR2F1）的反義 RNA，研究顯示，其在肝細胞癌[4]、骨肉瘤[5]等腫瘤中表達升高，干擾NR2F1-AS1表達可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。但NR2F1-AS1在結腸癌中的表達及其作用還未知。微小RNA（miRNA）在腫瘤進展中也起重要調控作用[6]。lnc RNA可調控miRNA的表達，兩者共同參與腫瘤進程[7]。生物信息學軟件預測顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。有報道顯示miR-145-5p在結直腸癌中表達降低，過表達miR-145-5p可抑制癌細胞增殖和侵襲，為結直腸癌的治療提供了潛在治療靶點[8]。目前，NR2F1-AS1能否靶向miR-145-5p調控結腸癌進展還未知。本研究主要探討了NR2F1-AS1和miR-145-5p對結腸癌HCT116細胞惡性行為的影響，分析NR2F1-AS1對miR-145-5p的靶向調控作用，以期從lncRNA/miRNA途徑揭示結腸癌進展的機制，并為結腸癌治療靶點選擇提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年3月至2017年5月青海省第五人民醫(yī)院外科手術切除并經(jīng)病理證實為原發(fā)性結腸腺癌組織25例，另留取距腫瘤邊緣3 cm的癌旁組織（正常結腸組織）。其中男16例，女9例，年齡（61.25±5.78）歲。組織高分化7例，中分化9例，低分化9例。淋巴結轉移14例，未轉移11例。病人術前未進行放、化療等治療。病人或其近親屬簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 細胞和實驗試劑結腸癌細胞株HCT116（中國科學院上海細胞庫），胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、LipofectamineTM2000試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1、pcDNA、miR-145-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-145-5p、antimiR-NC（上海吉瑪制藥技術有限公司），逆轉錄試劑盒、RNA抽提試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（上海生工生物工程公司），鼠抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體（北京中杉金橋生物試劑公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 HCT116細胞培養(yǎng) 復蘇HCT116細胞，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、濕度97%、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細胞生長狀況，待細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代。

1.3.2 NR2F1-AS1與miR-145-5p靶向關系驗證生物信息學軟件預測顯示，NR2F1-AS1與miR-145-5p結合的核苷酸序列。PCR擴增含miR-145-5p結合位點的NR2F1-AS1核苷酸序列，插入載體，構建NR2F1-AS1野生型熒光素酶報告載體（WT-NR2F1-AS1）。同時，將結合位點突變后構建NR2F1-AS1突變型熒光素酶報告載體（MUT-NR2F1-AS1）。用LipofectamineTM2000試劑盒分別將WT-NR2F1-AS1、MUT-NR2F1-AS1與miR-145-5p mimic或miR-NC共轉染。24 h后，收集細胞，檢測熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。分別轉染si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1及pcDNA至HCT116細胞，48 h后收集細胞，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-145-5p表達水平。

1.3.3 RT-qPCR檢測組織或細胞中NR2F1-AS1和miR-145-5p表達水平 RNA提取試劑盒分離總RNA，檢測RNA純度和濃度后將其逆轉錄為互補DNA（cDNA）。再以cDNA為模板，行PCR擴增。NR2F1-AS1正向5'-CAGCGGTGCAAACCATGTGC-3'，反向5'-GTAAACCAAGTCGGTTGAACG-3'；GAPDH正向5'-CAGTGCCAGCCTCGTCTATG APDH-3'，反 向 5'-CTTCTGACACCTACCGGGGA-3'；miR-145-5p 正向 5'-CCAGCTGGGCTCA CTGAACAATGA-3'，反向 5'-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6 正向 5'-TGCGGGTG CTCGCTTCGGCAGC-3'，反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。 GAPDH 為NR2F1-AS1的內(nèi)參，U6為miR-145-5p的內(nèi)參，用2－ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.3.4 細胞轉染和分組 取1×105個HCT116細胞接種6孔板，用Lipofectami-neTM2000分別將si-NR2F1-AS1（si-NR2F1-AS1組）、si-NC（si-NC組）、miR-145-5p mimcs（miR-145-5p 組）、miR-NC（miRNC組）、si-NR2F1-AS1與anti-miR-145-5p（si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組）、si-NR2F1-AS1與 anti-miR-NC（si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組）轉染60%融合的細胞。轉染48 h收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.3.5 CCK-8法檢測細胞增殖 各組細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每組設置3個復孔。將CCK溶液和細胞培養(yǎng)液按1∶9混合，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，取100 μL加入各孔內(nèi)孵育，全自動酶標儀在4 h后于450 nm處測定吸光度（optical density，OD）值。實驗重復3次。

1.3.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗：將無血清培養(yǎng)基和Matrigel按照8∶1混合，取50 μL鋪于Transwell上室備用。用無血清培養(yǎng)基重懸各組HCT116細胞調整濃度為5×104個/毫升。在上室、下室中分別加入100 μL細胞懸液、500 μL完全培養(yǎng)基。孵育48 h后取出上室。將Transwell膜下表面的細胞分別用4%多聚甲醛固定、0.4%結晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，對穿膜細胞計數(shù)。遷移實驗：無需鋪設Matrigel基質膠，后續(xù)實驗步驟與侵襲實驗相同。

1.3.7 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 RIPA法提取總蛋白后進行蛋白定量。取適量蛋白置于100℃煮沸5 min。冷卻至室溫后，每組樣本取30 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜后進行膜的封閉。用一抗孵育液在4℃孵育膜10 h。洗膜后，再用二抗孵育液在37℃孵育膜1 h。洗膜后，進行化學發(fā)光顯色、凝膠成像系統(tǒng)拍照。以Image J軟件分析蛋白條帶相對內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法利用SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織中NR2F1-AS1和miR-145-5p的表達與癌旁組織比較，結腸癌組織中NR2F1-AS1表達升高，miR-145-5p表達降低（P<0.05）。見表1。

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結腸癌組織中的表達/±s

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結腸癌組織中的表達/±s

注：①與癌旁組織比較，P<0.05。

組別癌旁組織結腸癌組織t值P值miR-145-5p 1.00±0.08 0.55±0.05①23.85 0.000例數(shù)25 25 NR2F1-AS1 1.01±0.11 3.39±0.33①34.21 0.000

2.2 NR2F1-AS1靶向調控miR-145-5p的表達NR2F1-AS1與miR-145-5p序列存在結合位點（圖1）。共轉染W(wǎng)T-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細胞熒光素酶活性為0.49±0.05，低于miR-NC組1.03±0.09（t=15.735，P<0.001）；而共轉染 MUT-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細胞熒光素酶活性為1.01±0.08，與miR-NC組細胞熒光素酶活性1.00±0.07比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.282，P=0.781）。pcDNANR2F1-AS1組miR-145-5p表達水平為0.44±0.04，低于 pcDNA 組 1.00±0.08（t=18.783，P<0.001）。 si-NR2F1-AS1組miR-145-5p表達水平為2.88±0.27，高于si-NC組0.98±0.09（t=20.028，P<0.001）。

圖1 NR2F1-AS1的序列中含有與miR-145-5p互補的核苷酸序列

2.3 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組相比，si-NR2F1-AS1組細胞中NR2F1-AS1表達水平降低（P<0.05），表明轉染si-NR2F1-AS1可干擾NR2F1-AS1表達。與si-NC組比較，si-NR2F1-AS1組P21蛋白水平高于si-NC組（P<0.05），CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數(shù)低于si-NC組（P<0.05）。見圖2和表2。

圖2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲影響的相關蛋白表達

表2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

組別MMP-9蛋白重復次數(shù)NR2F1-AS1 OD值（450 nm）24 h 48 h 72 h遷移細胞數(shù)/個侵襲細胞數(shù)/個CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白si-NC si-NR2F1-AS1 t值P值0.72±0.07 0.30±0.03 16.545 0.000 9 9 1.01±0.09 0.53±0.05 13.987 0.000 0.61±0.06 0.52±0.04 3.744 0.002 1.21±0.11 0.68±0.06 12.690 0.000 1.62±0.13 0.87±0.07 19.099 0.000 126.39±11.43 61.48±6.57 14.771 0.000 108.26±10.22 52.47±5.63 14.344 0.000 0.63±0.06 0.25±0.03 16.994 0.000 0.33±0.03 0.78±0.07 17.726 0.000 0.69±0.06 0.27±0.03 18.783 0.000

2.4 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響miR-145-5p組細胞miR-145-5p表達水平高于miR-NC組（P<0.05），表明轉染miR-145-5p mimics能夠上調miR-145-5p表達水平。miR-145-5p組細胞P21蛋白水平高于miR-NC組（P<0.05），而CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、OD值、遷移和侵襲數(shù)低于miR-NC組（P<0.05）。見圖3和表3。

圖3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲影響的相關蛋白表達

表3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

分組重復次數(shù)p21蛋白miR-145-5p 48 h 72 h遷移細胞數(shù)/個侵襲細胞數(shù)/個CyclinD1蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白OD值（450 nm）24 h miR-NC miR-145-5p t值P值1.00±0.071.25±0.101.66±0.14123.48±12.41103.59±10.360.61±0.060.32±0.030.68±0.060.74±0.07 0.35±0.03 15.363 0.000 9 9 2.84±0.27 19.790 0.000 0.62±0.06 0.59±0.05 1.152 0.266 0.74±0.07 12.534 0.000 0.96±0.08 13.024 0.000 68.36±6.58 11.772 0.000 59.33±5.42 11.356 0.000 0.28±0.03 14.758 0.000 0.71±0.07 15.363 0.000 0.33±0.03 15.652 0.000

2.5 抑制miR-145-5p表達逆轉了干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的作用si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組細胞CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數(shù)高于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組，miR-145-5p表達水平和P21蛋白水平低于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組（P<0.05）。見圖4和表4。

圖4 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表4 抑制miR-145-5p表達逆轉了干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的作用（xˉ±s，n=9）

3 討論

Lnc RNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調控因子。NR2F1-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種調控腫瘤發(fā)展進程的lnc RNA。Guo等[9]研究顯示，NR2F1-AS1在甲狀腺癌組織和細胞中呈高表達，其通過靶向上調miR-338-3P 表達抑制甲狀腺癌進展。Wang等[10]研究顯示，NR2F1-AS1在子宮內(nèi)膜癌中表達升高，抑制NR2F1-AS1表達對子宮內(nèi)膜癌細胞活力和轉移能力具有顯著抑制作用，這與其靶向上調miR-363表達有關。本研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中NR2F1-AS1表達水平明顯高于癌旁組織，提示NR2F1-AS1可能參與結腸癌啟動和發(fā)展。轉染si-NR2F1-AS1至結腸癌HCT116細胞進行功能實驗，結果顯示干擾NR2F1-AS1表達可降低HCT116細胞活力，減少遷移和侵襲細胞數(shù)，同時伴有促增殖蛋白CyclinD1、促轉移蛋白MMP-2和MMP-9的表達下降以及抗增殖蛋白P21蛋白的表達升高，提示NR2F1-AS1可能是結腸癌的潛在治療靶點。

生物信息學軟件預測顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。為探討NR2F1-AS1抗結腸癌的可能機制，本研究開展雙熒光素酶報告基因法證實NR2F1-AS1可與miR-145-5p直接結合。隨后的分析顯示干擾NR2F1-AS1能夠促進miR-145-5p表達，而NR2F1-AS1過表達則對miR-145-5p水平具有抑制作用，提示結腸癌中存在NR2F1-AS1/miR-145-5p 分子軸。miR-145-5p 在前列腺癌[11]、膀胱癌[12]、非小細胞肺癌[13]等腫瘤中表達降低，作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，miR-145-5p在結腸癌組織中呈低表達，過表達miR-145-5p可抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲，與相關報道結果一致[8]，證實miR-145-5p在結腸癌中的抑癌作用，提示上調miR-145-5p表達有助于阻礙結腸癌進程。本研究還顯示，干擾miR-145-5p表達可逆轉干擾NR2F1-AS1表達對HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示干擾NR2F1-AS1表達通過靶向上調miR-145-5p表達發(fā)揮抗結腸癌作用。

總之，在結腸癌組織NR2F1-AS1表達升高，干擾NR2F1-AS1可能通過上調miR-145-5p表抑制結腸癌細胞HCT116細胞惡性行為，發(fā)揮抗結腸癌作用，是結腸癌治療的潛在靶點。但本研究還存在不足之處，僅在細胞層面探討了NR2F1-AS1對結腸癌的影響，接下來將通過裸鼠實驗模型進一步探討NR2F1-AS1對結腸癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響及其它可能的調控機制。