結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1、磷酸化需肌醇酶1蛋白在鼻咽癌組織中表達及與其臨床病理特征、放療敏感度及預(yù)后的關(guān)系

張貴，尚蕾，李曉玲，代文意

鼻咽癌是一種頭頸部常見的惡性腫瘤，其在我國的發(fā)病率及病死率均較高[1]。盡管放化療技術(shù)在鼻咽癌的治療中取得了較好的效果，但遠處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)率仍較高[2]。目前有關(guān)鼻咽癌進展的相關(guān)機制仍不十分清楚，盡管其臨床分期對療效、復(fù)發(fā)等情況有一定的預(yù)測價值[3-4]，但仍無法較準確地判斷腫瘤的進展趨勢，因此，探索與鼻咽癌進展及預(yù)后相關(guān)的基因標志物，為尋求個體化治療方案提供依據(jù)，對提高鼻咽癌臨床療效及預(yù)后具有重要意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）在結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌等腫瘤組織中均表現(xiàn)為高表達，且與臨床分期及復(fù)發(fā)等情況密切相關(guān)[5-8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化需肌醇酶 1（p-IRE1）蛋白在多種惡性腫瘤細胞中均呈過度表達，同樣也會影響惡性腫瘤的發(fā)生及進展[9]。但目前針對MACC1、p-IRE1蛋白在鼻咽癌組織中表達情況及其與腫瘤嚴重程度關(guān)系的研究甚少。本研究采用SP免疫組化染色法分別對鼻咽癌組織中MACC1、p-IRE1蛋白表達情況進行檢測，并分析其與鼻咽癌病人臨床病理特征、放療敏感度及預(yù)后的關(guān)系，旨在為鼻咽癌放療效果預(yù)測以及尋求新的靶向治療提供一定的幫助和依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2018年12月在南陽市中心醫(yī)院行根治性調(diào)強放療的62例鼻咽癌病人的癌組織標本為鼻咽癌組。納入標準：（1）均為初治鼻咽癌病人的癌組織標本；（2）病理學(xué)依據(jù)明確且有完整的病歷資料；（3）均為鱗癌；（4）均經(jīng)病人同意并簽訂知情同意書。排除標準：有嚴重心腦血管疾病、肝、腎、胃腸基礎(chǔ)疾病及其他惡性腫瘤病史者。其中男44例，女18例，年齡（49.67±10.51）歲，范圍為37～62歲，TNM臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期34例；分化程度：高分化15例，中、低分化47例。同時選取同期20例健康人鼻咽部黏膜組織標本作為正常對照組，其中男14例，女6例，年齡（47.78±12.13）歲，范圍為32～64歲。兩組在性別、年齡方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 免疫組化染色將鼻咽癌組織標本及健康人鼻咽部黏膜組織標本經(jīng)4%甲醛固定后，常規(guī)進行石蠟包埋、切片。采用常規(guī)SP免疫組化染色法分別對鼻咽癌組織標本中MACC1、p-IRE1蛋白表達情況進行檢測，免疫組化試劑盒由福建邁新公司生產(chǎn)，MACC1及p-IRE1兔多克隆抗體均由英國Abcam公司生產(chǎn)。

1.3 觀察指標及隨訪觀察并記錄鼻咽癌組織標本及正常鼻咽部黏膜組織標本中MACC1、p-IRE1蛋白的表達情況，分析其與鼻咽癌病人臨床病理特征、放療敏感度的關(guān)系以及鼻咽癌組織中MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達的相關(guān)性。所有病人于放療結(jié)束后的2年內(nèi)每3個月隨訪一次，2年后每6個月隨訪一次，隨訪時間為5～48個月，中位隨訪時間為34個月，分析鼻咽癌病人放療后死亡的危險因素（截止至2019年12月）。

1.4 評價標準

1.4.1 陽性檢測結(jié)果判定 以已知預(yù)實驗結(jié)果陽性鼻咽癌組織切片作為陽性對照，而以PBS液代替一抗作為陰性對照。所有組織切片均由兩位資深病理科醫(yī)師采用隨機雙盲法獨立完成閱片。MACC1、p-IRE1染色主要體現(xiàn)在癌細胞細胞質(zhì)、細胞膜以及部分細胞核中，參考陽性標準相關(guān)文獻[10]，各蛋白均根據(jù)染色細胞比例及染色強度積分綜合判定陽性表達結(jié)果。染色細胞比例積分評定：每個組織樣本隨機選擇高倍鏡視野3個（×400），計算每個視野的染色細胞比例并取平均值，0分為染色細胞比例<10%，1分為10%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75，4分為>75%。染色強度積分評定：無色或基本不染色計為0分，淡黃色計為1分，黃色計為2分，棕黃色計為3分。以染色細胞比例積分×染色強度積分≥4分為陽性，<4分為陰性[11]。

1.4.2 放療敏感度評價 參考實體瘤的療效評價標準（RECIST），在完成放療1周時對放療敏感度進行評價，將完全緩解（CR，即腫瘤灶完全消失）和部分緩解（PR，即腫瘤灶相互垂直最長徑之和縮減≥30%）病人定義為放療敏感，將穩(wěn)定（SD，即病灶改變介于PR和PD之間）和進展（PD，腫瘤灶相互垂直最長徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新的病灶）病人定義為放療抗拒。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料用±s表示，采用t檢驗，應(yīng)用多因素COX回歸分析鼻咽癌病人放療后隨訪期間死亡的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織標本中各蛋白表達情況鼻咽癌組織標本中，MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達率均明顯高于正常鼻咽部黏膜組織標本，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 鼻咽癌組與正常對照組標本中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）、磷酸化需肌醇酶1（p-IRE1）蛋白表達情況/例（%）

2.2 MACC1、p-IRE1蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征、放療敏感度的關(guān)系鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達與TNM臨床分期和分化程度密切相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡無關(guān)（P>0.05），而鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達者放療敏感度均明顯低于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白表達見圖1。

表2 組織結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）、磷酸化需肌醇酶1（p-IRE1）蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征、放療敏感度的關(guān)系/例（%）

2.3 MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達的相關(guān)性鼻咽癌組織MACC1及p-IRE1蛋白陽性表達呈顯著正相關(guān)（χ2=12.18，P<0.001，列聯(lián)系數(shù)=0.405）。見表3。

表3 MACC1、Bcl-2、p-IRE1蛋白陽性表達的相關(guān)性/例

2.4 鼻咽癌病人放療后臨床預(yù)后及相關(guān)影響因素分析所有病人中無失訪病例。放療后隨訪期間有12例（19.35%）出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，14例（22.58%）出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移；死亡24例（38.71%），均死于局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌病人放療后死亡與TNM臨床分期、分化程度及鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白表達情況密切相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡無關(guān)（P>0.05），見表4。

表4 鼻咽癌放療后臨床預(yù)后相關(guān)影響因素分析/例（%）

2.5 鼻咽癌病人放療后死亡危險因素的COX回歸分析以放療后預(yù)后（死亡及存活）為因變量，將以上單因素分析中P<0.1的因素設(shè)為自變量，對鼻咽癌病人放療后死亡危險因素進行COX回歸分析，結(jié)果顯示，TNM臨床分期、鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達是鼻咽癌病人放療后死亡的獨立危險因素（P<0.05）。見表5。

表5 鼻咽癌病人放療后死亡危險因素的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

鼻咽癌居我國頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率之首，約有40%的病人以頸部淋巴結(jié)腫大就診[12]，確診時多已為中晚期，其中約20%的病人已有遠處轉(zhuǎn)移[3]。遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致鼻咽癌病人生存期縮短的主要原因，發(fā)現(xiàn)特異性參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因標志物對于鼻咽癌的個體化治療具有重要意義[3，13]。

MACC1基因由Stein等[14]在進行結(jié)腸癌的研究時發(fā)現(xiàn)，是HGF/C-met信號傳導(dǎo)通路的連接蛋白，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中表現(xiàn)為異常的高表達，具有誘導(dǎo)細胞增殖、分化及遷移等作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MACC1基因位于人7號染色體上，由ZU5、SH3及2個羥基結(jié)構(gòu)域組成，其中2個羥基結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸殘基在出現(xiàn)DNA損失等情況時會發(fā)生殘基磷酸化，使得信號傳導(dǎo)通路發(fā)生級聯(lián)酶促反應(yīng)，造成無限制的細胞分裂，而導(dǎo)致腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15-16]。國內(nèi)外已有大量研究發(fā)現(xiàn)，MACC1蛋白在正常組織中往往不表達或者低表達，而在結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性實體瘤中均有表達，且高表達常提示惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率較高，往往預(yù)后較差。另外，Meng等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中MACC1蛋白的表達也較鼻咽炎組織及正常鼻咽組織明顯升高（P<0.05）。梁榮等[3]的研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中MACC1蛋白陽性表達率達68.5%，且其表達與腫瘤臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在明顯相關(guān)性（P<0.05）。而本研究中采用SP免疫組化染色法檢測鼻咽癌組織中MACC1蛋白表達情況，結(jié)果顯示，MACC1蛋白陽性表達率為70.97%，明顯高于健康人鼻咽部黏膜組織（15.00%），且隨著鼻咽癌病人TNM臨床分期升高或分化程度降低，MACC1蛋白表達陽性的比例升高，與以往的研究結(jié)論基本一致。而鼻咽癌組織MACC1蛋白表達陽性者放療敏感度顯著低于陰性者（70.45%比100%），提示鼻咽癌組織MACC1蛋白表達對放療敏感度的預(yù)測具有重要意義。

IRE1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，能夠感受錯誤折疊/未折疊蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔蓄積水平，引發(fā)相應(yīng)激酶結(jié)構(gòu)的改變，經(jīng)過磷酸化而形成p-IRE1，最終引發(fā)下游生物學(xué)效應(yīng)[18-19]。IRE1可激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶ASK1、氨基末端激酶JNK及核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，調(diào)節(jié)細胞凋亡、遷移等反應(yīng)[20]。以往關(guān)于腫瘤的大量研究發(fā)現(xiàn)，IRE1在子宮頸癌、骨惡性腫瘤、乳腺癌中均存在較正常組織的過表達[9，21-22]，且在不同臨床分期癌組織中的表達存在較明顯差異[21]。本研究結(jié)果顯示，p-IRE1蛋白陽性表達率為66.13%，明顯高于健康人鼻咽部黏膜組織（15.00%），且隨著鼻咽癌病人TNM臨床分期升高或分化程度降低，p-IRE1蛋白表達陽性的比例升高，與以往的研究結(jié)論基本一致。而王歡等[19]的研究則認為，鼻咽癌病人p-IRE1蛋白表達程度與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在相關(guān)性，與臨床分期不存在相關(guān)性，但也不能認為其研究結(jié)論與本研究存在明顯差異，因為兩個研究中p-IRE1蛋白表達的定義不同，本研究中蛋白表達是指陽性表達與陰性表達，而王歡等研究中指的是高表達與低表達。而鼻咽癌組織p-IRE1蛋白表達陽性者放療敏感度亦顯著低于陰性者（70.73%比95.24%），提示鼻咽癌組織MACC1蛋白表達對放療敏感度同樣具有一定的預(yù)測價值。

另外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織MACC1及p-IRE1蛋白陽性表達呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)（列聯(lián)系數(shù)=0.405，P<0.01），提示對鼻咽癌組織中MACC1及p-IRE1蛋白陽性表達情況進行綜合分析，可能會在一定程度上提高對鼻咽癌臨床分期及病理分化程度的預(yù)測價值。而進一步對鼻咽癌病人放療后死亡危險因素進行分析顯示，除以往研究證實的TNM臨床分期外，鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白陽性表達也是鼻咽癌病人放療后死亡的獨立危險因素（P<0.05），與QIU等[23]在肝癌、江俊偉與葛林虎[24]在肺癌以及梁榮等[3]、王歡等[19]、田雙雙等[25]在鼻咽癌中的研究結(jié)論基本一致。提示鼻咽癌組織MACC1、p-IRE1蛋白表達可能是惡性腫瘤預(yù)后的獨立預(yù)測指標。

綜上所述，鼻咽癌病人MACC1及p-IRE1蛋白檢測可能有助于鼻咽癌病人臨床分期、病理分化程度以及放療敏感度的判斷，其陽性表達是鼻咽癌預(yù)后的獨立危險因素，可能成為鼻咽癌基因治療的新靶點，但仍有待進一步的大樣本收集及長期、密切隨訪分析加以證實。

（本文圖1見插圖2-1）