錨蛋白B在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

代文意

鼻咽癌是一種低分化、高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。由于鼻咽部位隱匿，鼻咽癌的臨床癥狀多樣，導(dǎo)致多數(shù)病人在確診時(shí)已出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。目前，鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未明確，因此，探討影響鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于該疾病的治療具有重要意義。錨蛋白B（ANK2）是細(xì)胞骨架家族成員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命活動(dòng)。ANK2對(duì)多種腫瘤的發(fā)展具有調(diào)控作用。ANK2在肝癌病人組織中表達(dá)增加，是影響病人預(yù)后生存的獨(dú)立因素[3]；遷移和侵襲受到抑制的耐長(zhǎng)春新堿胃癌細(xì)胞中ANK2表達(dá)降低[4]。目前，ANK2在鼻咽癌中的表達(dá)及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性行為的影響還未知。本研究主要檢測(cè)了ANK2基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析了ANK2基因與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系，并通過(guò)轉(zhuǎn)染ANK2小干擾RNA至鼻咽癌細(xì)胞，探討了干擾ANK2表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響極可能的作用機(jī)制，以期為鼻咽癌的靶向分子治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年10月至2018年10月南陽(yáng)市中心醫(yī)院存檔的67例鼻咽癌組織蠟塊為研究對(duì)象，其中男性39例，女性28例，年齡（56.34±6.72）歲，年齡范圍為34～69歲。其中高分化鼻咽癌15例，中分化20例，低分化32例。按照鼻咽癌TNM分期分為Ⅰ期11例，Ⅱ期11例，Ⅲ期16例，Ⅳ期29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）獲取組織學(xué)標(biāo)本前，病人無(wú)鼻咽癌放化療史；（2）病人一般資料完整。另選取50例鼻咽部炎癥組織作為對(duì)照組，其中男性27例，女性23例，年齡（57.19±6.85）歲，年齡范圍為31～70歲。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

兩組病人或其近親屬簽署了知情同意書(shū)。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69和鼻咽癌細(xì)胞系6-10B、5-8F，美國(guó)模式菌種收集中心；胎牛血清（FBS），浙江天杭；MTT、二喹啉甲酸（BCA）、RPMI 1640培養(yǎng)基和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶；RNA抽屜試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；LipofectamineTM2000試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3βser9）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和c-myc抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；引物序列、ANK2小干擾RNA及亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC），上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇NP69、6-10B和5-8F細(xì)胞，均用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）檢測(cè)組織或細(xì)胞中ANK2 mRNA水平 用RNA抽屜試劑盒提取組織或細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列ANK2正向5'-CAGCTACATTGTGTGGCATTCTA-3'，反向 5'-CTACAGTGCAGTGGCCAGAAG-3'；GAPDH 正 向 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反 向 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。 2－ΔΔCt法 計(jì) 算 ANK2 mRNA相對(duì)GAPDH的表達(dá)量。

1.3.3 5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)染 于6孔板中培養(yǎng)5-8F細(xì)胞（1.0×105個(gè)/孔），24 h后，用混合均勻的LipofectamineTM2000試劑與si-ANK2（si-ANK2組）或si-NC（si-NC組）孵育12 h。然后更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中ANK2 mRNA表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，5-8F細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖 于96孔板中培養(yǎng)對(duì)照組、si-NC組和si-ANK2組細(xì)胞（2.5×104個(gè)/孔），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，加20μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加150μL二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度（A）。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將對(duì)照組、si-NC組和si-ANK2組細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×104個(gè)/毫升。遷移實(shí)驗(yàn)：于Transwell小室上室加100 μL各組細(xì)胞懸液，下室加500 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，取出小室。將各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，然后置于0.4%結(jié)晶紫染色液中將細(xì)胞染色15 min。用PBS清洗后，顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell上室，自然晾干后，再加100 μL各組細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)5-8F細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 于6孔板中培養(yǎng)對(duì)照組、si-NC組和si-ANK2組細(xì)胞（1.0×105個(gè)/孔），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，并用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)分離蛋白，并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉中封閉2 h。分別置于稀釋后的 p-GSK3βser9（1∶400）、β-catenin（1∶400）和 c-myc（1∶400）抗體中4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，置于辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶200）中室溫孵育1 h。洗膜后，加顯影液顯影，曝光拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。χ2檢驗(yàn)分析鼻咽癌組織中ANK2 mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。以±s表示計(jì)量資料，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANK2基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)ANK2 mRNA在鼻咽部炎癥組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)水平分別為（1.05±0.08）、（2.57±0.19）。與鼻咽部炎癥組織比較，鼻咽癌組織中ANK2 mRNA表達(dá)升高（t=53.119，P<0.001）。ANK2 mRNA在NP69細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞6-10B和5-8F中的表達(dá)水平分別為（1.06±0.09）、（2.34±0.16）、（2.95±0.21）。與 NP69細(xì)胞比較，鼻咽癌細(xì)胞6-10B和5-8F中ANK2 mRNA表達(dá)升高（t=20.918，P<0.001；t=24.817，P<0.001）。由于鼻咽癌5-8F細(xì)胞中ANK2 mRNA表達(dá)水平高于6-10B細(xì)胞，因此選擇5-8F細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ANK2基因表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)NK2高表達(dá)與鼻咽癌病人腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），與病人年齡、性別無(wú)關(guān)（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 錨蛋白B（ANK2）基因表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 ANK2小干擾RNA轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證對(duì)照組、si-NC組、si-ANK2組5-8F細(xì)胞中ANK2 mRNA表達(dá)水平分別為（1.06±0.08）、（1.04±0.07）、（0.36±0.03）。與si-NC組比較，si-ANK2組5-8F細(xì)胞中ANK2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（t=26.787，P<0.001）。對(duì)照組與si-NC組5-8F細(xì)胞中ANK2 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.564，P=0.580）。

2.4 干擾ANK2表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響si-ANK2組5-8F細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均低于si-NC組（P<0.001）。對(duì)照組與si-NC組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 干擾錨蛋白B（ANK2）表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)的影響/±s

表2 干擾錨蛋白B（ANK2）表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P<0.05。

細(xì)胞存活率/%100±3.26 98.64±2.57 45.29±1.23①3 238.05 0.000組別對(duì)照組si-NC si-ANK2 F值P值9 9 9重復(fù)次數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)142.69±10.24 138.64±10.13 61.21±5.08①244.04 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)102.38±8.71 98.46±8.14 43.98±4.39①178.28 0.000

2.5 干擾ANK2表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響與si-NC組比較，si-ANK2組5-8F細(xì)胞p-GSK3βser9、β-catenin和c-myc蛋白水平顯著降低（P<0.001）。對(duì)照組與si-NC組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)兔抗人磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3βser9）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和c-myc蛋白表達(dá)

表3 干擾錨蛋白B（ANK2）表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞兔抗人磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3βser9）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和c-myc蛋白表達(dá)的影響/±s

表3 干擾錨蛋白B（ANK2）表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞兔抗人磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3βser9）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和c-myc蛋白表達(dá)的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P<0.05。

分組對(duì)照組si-NC si-ANK2 F值P值c-myc 0.56±0.06 0.58±0.07 0.19±0.02①146.33 0.000重復(fù)次數(shù)9 9 9 p-GSK3βser9 0.51±0.06 0.49±0.05 0.21±0.03①108.51 0.000 β-catenin 0.87±0.09 0.92±0.11 0.32±0.04①137.27 0.000

3 討論

ANK2基因的過(guò)度表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，干擾ANK2表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展[5]；ANK2表達(dá)的下調(diào)有效削弱了胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移性，下調(diào)ANK2可延緩胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程[6]。本研究結(jié)果顯示，ANK2基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，其高表達(dá)與鼻咽癌病人腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)等臨床病理特征密切相關(guān)，提示ANK2與鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)；通過(guò)進(jìn)一步轉(zhuǎn)染ANK2小干擾RNA至鼻咽癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)干擾ANK2的鼻咽癌細(xì)胞的存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均降低，說(shuō)明干擾ANK2阻礙了鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這提示ANK2是鼻咽癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是近年來(lái)腫瘤分子學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[7]。在LRP蛋白的作用下，Wnt蛋白作用于Frz蛋白激活細(xì)胞內(nèi)的Dvl蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使GSK-3β磷酸化并抑制其活性，進(jìn)而抑制β-catenin降解，使其蓄積[8]。細(xì)胞質(zhì)中游離的β-catenin轉(zhuǎn)入細(xì)胞核后，進(jìn)一步激活下游Cyclin D1、c-myc等靶基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9-12]。研究顯示，核仁和紡錘體相關(guān)蛋白1（NUSAP1）能夠通過(guò)增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性表型，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)展進(jìn)程[13]。本研究結(jié)果顯示，干擾ANK2表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞中p-GSK3βser9、β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)降低，說(shuō)明干擾ANK2表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路，這也可能是干擾ANK2抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的原因之一。

綜上所述，鼻咽癌組織和細(xì)胞系中ANK2基因表達(dá)升高，干擾ANK2表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有顯著抑制作用，這可能與干擾ANK2表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)，ANK2有可能成為鼻咽癌的治療的新靶點(diǎn)。