轉錄因子叉頭框蛋白O3a對前列腺癌細胞上皮間質轉化的影響

夏明亮，任川川，李云龍，朱海松，張超 ，李軍

前列腺癌是因前列腺上皮細胞惡性增生引起的惡性腫瘤，可引起男性患者排尿異常、盆腔不適和陰莖勃起障礙，其發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為年齡、遺傳、環(huán)境、肥胖等因素可能與前列腺癌發(fā)病有關[1]。早期前列腺癌患者可以通過根治術或者根治性放療等方式進行治療，但大部分前列腺癌早期患者臨床癥狀不明顯，導致確診時病情已經(jīng)惡化，甚至病灶已經(jīng)擴展至前列腺外，導致傳統(tǒng)治療方式無法取得預想治療效果[2-3]。因此，探究前列腺發(fā)病機制對提高靶向治療、免疫檢查點治療等具有重要意義。叉頭框蛋白（forkhead box protein，F(xiàn)OX）家族涵蓋多種轉錄因子，這些轉錄因子參與細胞增殖、分化等過程，F(xiàn)OX家族成員具有多種DNA結合域，從而引起轉錄抑制或激活[4]。叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）是FOX家族的亞組，在細胞增殖、活性、應激反應中發(fā)揮重要作用，叉頭框 轉 錄 因 子 O3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）是FOXO成員之一。FOXO3a不僅參與胚胎、組織細胞發(fā)育進程[5]，還參與細胞凋亡、增殖、免疫應答[6]、DNA損傷等生理過程，廣泛參與多種疾病發(fā)生和進展，其中包括乳腺癌、肝癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌和鼻咽癌等惡性腫瘤。FOXO3a在癌細胞系中常因其基因突變或蛋白胞質隔離而失活，其蛋白失活與癌癥發(fā)生、進展具有密切關系，F(xiàn)OXO3a表達水平異?？梢杂绊懩[瘤細胞增殖、侵襲性、上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），有學者[7]認為FOXO3a在正常生理和癌癥進展中的作用對研制有效的治療策略產(chǎn)生巨大挑戰(zhàn)?；诖?，本研究自2020年1―8月通過構建FOXO3a過表達前列腺癌細胞系，旨在探討FOXO3a對前列腺癌細胞EMT的影響及其可能作用機制，希望能為前列腺癌治療策略提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 材料 pcDNA-FOXO3a、pcDNA-NC均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計和構建，人正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺細胞系LNCaP、DUl45、PC-3均由美國典型菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑 SFM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自拿大Life Technologies公司，Lipofecamine TM2000脂質轉染試劑、TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國ThermoFisher公司，SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，細胞活性噻唑藍（MTT）試劑盒購自北京美科美生物技術開發(fā)有限公司，鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)型鈣黏附蛋白（N-cadherin）、c-Myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、Bcl-2相關X（Bax）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Wnt1抗體購自武漢益普生物科技有限公司，剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-Cas-3）抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司，Snail、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體購自上海恒斐生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG購于美國Thermo公司，細胞裂解液、ECL化學發(fā)光試劑個購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SanYo公司，電泳儀購自美國Bio-red，凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司，逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀購自美國Thermo公司，SpectraMax iD3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司，DMi8-電動熒光顯微鏡購自奧地利徠卡，Aurora 3～5 L流式細胞儀購自美國Cytek Biosciences公司，相關儀器耗材購于德國eppendorf公司，transwell小室、細胞劃痕組件、相關耗材購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)RWPE-1細胞置于K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LNCaP、DUl45、PC-3細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，二氧化碳培養(yǎng)箱條件為37℃、5%二氧化碳飽和濕度，隔天換液，細胞融合度達75%時進行傳代，細胞傳代3次達穩(wěn)定狀態(tài)時用于研究。

1.3 RT-PCR依據(jù)TRIzol試劑盒提取細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度，運用cDNA反轉錄試劑盒進行第一條鏈cDNA合成，采用SYBR PCR Master Mix對細胞中的FOXO3a水平進行檢測，PCR程序參數(shù)設置參考試劑盒說明書，95℃30 s，95℃5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，42個循環(huán)，以U6作為內參基因，采用 2-ΔΔCt法分析待測基因表達量[8]，所用引物均由上海生工提供。RT-PCR結果顯示LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a水平均呈顯著降低，并且其中LNCaP細胞中FOXO3a水平是3個前列腺癌細胞系中最低，由此選擇LNCaP細胞系作為后續(xù)細胞轉染材料。

1.4 細胞轉染調整對數(shù)生長期LNCaP細胞濃度為1×106/mL，取2 mL細胞懸浮液置于6孔板中，采用不含血清的培養(yǎng)基于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)至細胞密度達到60%，然后采用參照LipofecamineTM2000試劑說明書將pcDNA-FOXO3a、pcDNANC轉染至LNCaP細胞中并分別記為FOXO3a過表達細胞系（pc-FOXO3a）和陰性對照（NC），未進行轉染的LNCaP細胞記為Control。轉染48 h后，收集各組細胞，并采用RT-PCR炎癥為FOXO3a表達水平，步驟同1.3。

1.5 細胞活性檢測采用MTT法檢測LNCaP細胞活性，以1×106/mL、每孔100 μL方式接種96孔板于1.2細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h，然后加入0.5 g/L MTT溶液（每孔 100 μL），培養(yǎng) 4 h，吸棄上清液再加入DMSO（每孔200 μL）孵育30 min，多功能酶標儀波長570 nm處檢測各孔吸光值（A值），計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組的A值-空白孔A值）/（對照組的A值-空白孔A值）×100%。

1.6 流式細胞檢測細胞凋亡采用Annexin VFITC/PI雙染流式細胞法檢測LNCaP細胞凋亡情況，將細胞以5×105/mL、每孔 400 μL方式接種至6孔板，培養(yǎng)條件和時間同1.5，收集細胞，1 000 r/min、5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入300 μL 1×Binding Buffer，重懸 細胞 ，加 入 5 μL Annex-inV/FITC、10μl PI混合，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀上樣，CellQuest軟件統(tǒng)計分析細胞凋亡率。

1.7 細胞侵襲實驗調整pc-FOXO3a、NC、Control LNCaP細胞密度為1×105/mL，Transwell小室預先用Matrigel膠包被，下層加入含血清培養(yǎng)基，將LNCaP細胞轉至上層無血清培養(yǎng)，每組3個復孔，37℃，5%二氧化碳孵育培養(yǎng)48 h，無菌棉簽擦去小室內未侵襲的細胞，結晶紫染色侵襲至下層細胞，每孔采用隨機數(shù)字表法選取7個視野統(tǒng)計計數(shù)，實驗至少重復3次。

1.8 細胞劃痕將劃痕實驗插件置于24孔板，調整 pc-FOXO3a、NC、Control LNCaP 細胞量為 5×105個，同1.2細胞培養(yǎng)條件孵育過夜（約16 h），小心移去劃痕實驗插件，用完全培養(yǎng)基潤洗3次，加入10 μmol/L絲裂霉素，孵育2 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基，顯微鏡下計時拍照，首次拍照為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h拍照分析細胞的遷移情況。

1.9 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測收集1.5、1.6中的細胞置于1.5 mL離心管，加入細胞裂解液冰浴裂解30 min，取上清液用于細胞總蛋白提取，Bradford法調整蛋白濃度一致性，經(jīng)過12%SDSPAGE電泳分離、濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加入封閉液孵育2 h，加入Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、c-Myc、cyclin D1、Wnt1、Cleaved-Cas-3、Snail、β-catenin 一抗孵育過夜（稀釋比例均為1∶1 000），TBST漂洗40 min，二抗孵育2 h（稀釋比例均為1∶5 000），ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶，用Image J對蛋白質條帶進行半定量分析目標條帶灰度值。

1.10 氯化鋰作用于pc-FOXO3a LNCaP細胞細胞培養(yǎng)條件同1.2，調整pc-FOXO3a LNCaP細胞密度為1×106/mL，接種96孔板、每孔100 μL，預培養(yǎng)24 h，向細胞培養(yǎng)基中加入氯化鋰（Wnt/β-catenin信號通路激活劑）是其終濃度為25 mmol/L（LiCl-pc-FOXO3a），對照組pc-FOXO3a LNCaP細胞（LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl）中加入等體積的二甲基亞砜（DMSO），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用1.5～1.9法分析細胞活性、凋亡和上皮間質轉換（EMT）情況。

1.11 統(tǒng)計學方法用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 5對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FOXO3a在 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中表達情況通過RT-PCR檢測結果顯示LNCaP、DUl45、PC-3細胞中的FOXO3a表達量顯著低于RWPE-1（P<0.05），并且LNCaP細胞在3種前列腺癌細胞系中FOXO3a表達量最低（表1）。

表1 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達水平/±s

表1 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達水平/±s

注：①與RWPE-1比較，P<0.05。

細胞系 重復次數(shù)FOXO3a RWPE-13 1 LNCaP30表達水平（2-ΔΔCt）DUl453 PC-33 F值P值.02±0.08.23±0.04①0.53±0.05①0.42±0.06①289.87 0.000

2.2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響通過RT-PCR檢測結果pc-FOXO3a LNCaP細胞中的 FOXO3a表達量（6.35±0.14）顯著高于 NC LNCaP細胞（1.01±0.05）（P<0.05），表明FOXO3a過表達LNCaP細胞構建成功。pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞的活性和Bcl-2水平顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05），而細胞凋亡率、Cleaved-Cas-3和Bax水平顯著高于NC LNCaP細胞（P<0.05）；LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞活性和Bcl-2水平顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05），而細胞凋亡率、Cleaved-Cas-3和Bax水平顯著低于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表2，表3，圖1）。

表2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響/（%，±s）

表2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響/（%，±s）

注：①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

重復次數(shù)3 3 3 3 3組別control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值細胞存活率100.00±0.00 100.00±0.00 57.65±4.59①78.58±5.14②58.32±4.98①274.78 0.000凋亡率1.19±0.32 1.20±0.34 48.63±5.11①23.98±5.04②48.52±4.92①332.67 0.000

表3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響/±s

表3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響/±s

注：Cleaved-Cas-3為剪切型胱天蛋白酶-3，Bax為Bcl-2相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別 重復次數(shù)Bax Bcl-2 Cleaved-Cas-3 0.22±0.03 0.23±0.04 0.82±0.06①0.49±0.05②0.81±0.05①3 3 3 3 3 0.23±0.04 0.21±0.04 0.76±0.05①0.42±0.09②0.78±0.05①1.18±0.06 1.19±0.05 0.35±0.05①0.76±0.05②0.36±0.05①570.01 0.000 control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值353.64 0.000 212.16 0.000

圖1 Western blotting檢測LNCaP細胞凋亡率及凋亡蛋白表達

2.3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移能力的影響pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞的單個視野細胞侵襲數(shù)目、劃痕遷移率顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05），LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞單個視野細胞侵襲數(shù)目、劃痕遷移率顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表4）。

表4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移的影響/±s

表4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移的影響/±s

注：①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別劃痕遷移率/%重復次數(shù)單個視野細胞侵襲數(shù)control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值82.36±4.25 82.41±4.36 42.12±5.14①67.87±5.63②43.21±5.01①149.75 0.000 3 3 3 3 3 95.65±2.35 95.12±3.62 62.49±5.08①79.65±4.88②62.98±5.33①124.14 0.000

2.4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiClpc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞Vimentin、N-cadherin、Snail、c-Myc、cyclin D1水平顯著低于NC LNCaP 細胞（P<0.05），而E-cadherin水平顯著高于NC LNCaP細胞（P<0.05）；LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞 imentin、N-cadherin、Snail、c-Myc、cyclin D1水平顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05），而 E-cadherin水平顯著低于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表5，圖2）。

表5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響/±s

表5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響/±s

注：E-cadherin為鈣黏附蛋白E，Vimentin為波形蛋白，N-cadherin為神經(jīng)型鈣黏附蛋白，cyclin D1為細胞周期蛋白D1。①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值cyclin D1 0.98±0.04 0.99±0.03 0.18±0.03①0.68±0.04②0.19±0.03①1234.30 0.000重復次數(shù)3 3 3 3 3 E-cadherin 0.20±0.03 0.21±0.04 0.91±0.05①0.62±0.05②0.92±0.06①513.93 0.000 Vimentin 1.09±0.04 1.08±0.04 0.31±0.05①0.72±0.04②0.32±0.05①681.11 0.000 N-cadherin 1.16±0.05 1.17±0.05 0.22±0.04①0.81±0.05②0.23±0.04①940.25 0.000 Snail 0.98±0.04 1.01±0.05 0.15±0.04①0.51±0.05②0.16±0.04①814.45 0.000 c-Myc 1.24±0.05 1.25±0.05 0.26±0.03①0.76±0.05②0.25±0.03①1185.82 0.000

圖2 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

2.5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/βcatenin信號通路的影響Western blot檢測結果顯示pc-FOXO3a LNCaP細胞中的β-catenin、Wnt1水平顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05）（表6，圖3）。

表6 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響/±s

表6 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響/±s

注：①與NC比較，P<0.05。

組別control NC pc-FOXO3a F值P值Wnt 1.10±0.06 1.07±0.05 0.52±0.06①296.81 0.000重復次數(shù)3 3 3 β-catenin 1.05±0.05 1.09±0.06 0.62±0.06①189.00 0.000

圖3 Western blotting檢測Wnt、β-catenin信號通路蛋白表達

3 討論

FOXO3a是由110AA折疊形成的ɑ螺旋（3個）與翅膀形狀答環(huán)結（2個）DNA結合域，F(xiàn)OX03a在多種生物中均有分布，小鼠該基因定位于10號染色體，人類該基因定位于6號染色體。FOXO3a可以通過調控下游靶基因參與自噬、凋亡、細胞分化、免疫應答等多種生理過程，還參與乳腺癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤發(fā)病有關。近年來研究表明FOXO3a在多種癌癥疾病中起著抑癌作用，在癌細胞系中可表現(xiàn)為基因突變或其蛋白胞質隔離失活，此狀態(tài)與癌癥發(fā)生、進展有關[9]。本研究通過RT-PCR檢測正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌不同細胞系（LNCaP、DUl45、PC-3）中FOXO3a表達量，發(fā)現(xiàn)LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達量均顯著低于RWPE-1細胞，并且LNCaP細胞中的FOXO3a表達量降低最顯著，本研究結果與前人研究趨勢相似，表明FOXO3a表達異?？赡軈⑴c前列腺癌發(fā)病過程。

本研究通過構建FOXO3a表達升高LNCaP細胞系，發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞活性降低，而細胞凋亡率升高，表明FOXO3a表達升高可以降低前列腺癌LNCaP細胞活性，促進細胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞中的cyclin D1、Bcl-2水平顯著減低，而Cleaved-Cas-3、Bax水平顯著升高。Caspases-3位于Caspases級聯(lián)反應的末端，在Caspases介導凋亡途徑中充當執(zhí)行者[10]。Bcl-2可抑制DNA損傷產(chǎn)生的細胞凋亡信號活化，是線粒體膜電位發(fā)生變化，阻礙氧自由基、脂質過氧化物合成，負向調控細胞凋亡[11-12]。Bax是對細胞膜通透性具有增強效果的Bcl-2相關蛋白，對Caspases級聯(lián)反應中相關因子有活化作用，促進細胞凋亡級聯(lián)反應進行，Bax、Bcl-2在正常生理條件下處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其中比值能夠反應細胞凋亡情況[13-14]。β-arrestin1可以通過Akt、ERK1/2途徑抑制FOXO3a的轉錄活性，促進前列腺癌細胞增殖和EMT[15]。雌激素受體ERβ表達升高會促進細胞凋亡，推測是因為ERβ經(jīng)轉錄調控FOXO3a表達量升高，F(xiàn)OXO3a可促進凋亡因子PUMA表達上調，從而激活線粒體、Caspase級聯(lián)介導的凋亡活化，從而促進細胞凋亡[16]。cyclin D1為細胞周期蛋白，參與細胞周期運行過程，與CDK4結合后活化誘導細胞從G1期進入S期，在細胞增殖過程中起著促進作用，由此推測FOXO3a表達升高降低LNCaP細胞活性可能與降低cyclin D1表達細胞周期正常運轉有關，其中機制還需深入研究。

FOXO3a在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出表達量降低趨勢，其失活可促進腫瘤細胞EMT，對腫瘤細胞侵襲、轉移有促進效果，認為FOXO3a有望成為惡性腫瘤預后、腫瘤轉移的生物標志生物[17]。正常的上皮細胞為單層并由粘附蛋白固定，防止細胞移動，而在惡性腫瘤進展過程中，上皮細胞可以進行EMT，EMT 在肺癌[18]、宮頸癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]、前列腺癌[22]等惡性腫瘤進展中起著重要作用，促進腫瘤細胞向病灶外轉移。當細胞發(fā)生EMT時，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達水平降低，而間質細胞標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）以及波形蛋白（Vimentin）的表達含量升高[23]。Snail蛋白為EMT過程中的關鍵調控因子，與許多腫瘤EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關[24]。本研究結果發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞的侵襲和遷移能力、N-cadherin、Vimentin、Snail、c-Myc水平降低，而E-cadherin水平升高，由此表明FOXO3a表達升高會抑制LNCaP細胞的侵襲能力，可能與影響EMT相關蛋白水平有關。

已有文獻[25]表明FOXO可以協(xié)調多種EMT相關通路或相關轉錄因子參與EMT調節(jié)過程。Wnt/β-catenin信號通路參與調控胚胎發(fā)育、組織器官形成以及多種疾病發(fā)病過程，其在多種惡性腫瘤中常處于激活狀態(tài)，并且與惡性腫瘤的EMT存在密切關系[26]。本研究結果顯示pc-FOXO3a LNCaP細胞的β-catenin、Wnt1水平顯著降低，Wnt1是 Wnt/βcatenin信號通路胞外調控的重要蛋白，β-catenin主要參與細胞內信號傳遞過程[27]，由此表明FOXO3a表達升高可能會影響Wnt/β-catenin信號通路活化。有研究[28]表明沉默F(xiàn)OXO3a可誘導鼻咽癌細胞的EMT和Wnt/β-catenin信號通路激活，增強鼻咽癌細胞的放射抵抗，還有學者[29]認為FOXO3a可以調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路并對EMT產(chǎn)生抑制作用。為了驗證FOXO3a表達升高是否會抑制Wnt/βcatenin信號通路激活，本研究采用Wnt/β-catenin信號通路激活劑（LiCl）[30]作用 pc-FOXO3a LNCaP 細胞，發(fā)現(xiàn)LiCl可以緩解FOXO3a表達升高引起的細胞活性和侵襲能力降低、細胞凋亡增加，并對凋亡相關蛋白水平和EMTC相關蛋白水平也存在一定緩解作用。由此表明，F(xiàn)OXO3a表達升高可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活化從而抑制前列腺LNCaP細胞的EMT。

綜上所述，F(xiàn)OXO3a表達升高可降低前列腺癌LNCaP細胞活性、促進細胞凋亡，可能與調節(jié)c-Myc、cyclin D1、Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2水平有關；FOXO3a表達升高還可降低前列腺癌LNCaP細胞侵襲和遷移能力，可能與提高E-cadherin水平，降低Vimentin、N-cadherin、Snail水平以及抑制 Wnt/βcatenin信號通路活化有關。本研究觀點是通過體外細胞實驗所得，在動物體內是否存在相似趨勢尚不清楚，還需深入研究。