酒精性肝炎病人血清微小核糖核酸-182和微小核糖核酸-30e檢測及臨床意義

李藝明，鄧倩曦

酒精性肝炎是指長期過量飲酒所致的肝臟炎癥反應(yīng)性疾病，可隨著疾病的發(fā)展出現(xiàn)肝硬化、肝衰竭等，危害甚重。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，我國酒精性肝病的患病率約為4.34%，其中酒精性肝炎、酒精性肝硬化分別為1.51%、0.68%，且酒精性肝炎伴肝硬化病人預(yù)后差，5年生存率僅為40%左右，因此需對酒精性肝炎病人明確診斷、及早治療。當(dāng)前臨床上常用的酒精性肝炎指標(biāo)主要包括肝功能、肝纖維化指標(biāo)等，但均缺乏特異性，且臨床意義有限。微小核糖核酸（miR）-182定位于人類7號染色體（7q32.2），可與miR-96、miR-183形成基因簇，可以調(diào)節(jié)生物體的生長、發(fā)育及分化，并且與視力、聽力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等疾病發(fā)生關(guān)系密切[2-3]。研究指出[4]，miR-182與酒精依賴有相關(guān)性，且與肝細(xì)胞癌、肝硬化等也有緊密關(guān)聯(lián)。miR-30e可靶向調(diào)控自噬相關(guān)基因，與生物體的代謝、腫瘤的生長等均有密切關(guān)聯(lián)。有研究指出[5]，非酒精性脂肪肝病人中外周血miR-30e水平偏低，且對肝癌也有診斷價(jià)值。但目前關(guān)于酒精性肝炎病人血清miR-182和miR-30e水平檢測及意義尚鮮有報(bào)道。為探討上述問題，本研究分別對98例酒精性肝炎病人和89例健康志愿者的資料展開回顧性分析，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年10月綿陽市第三人民醫(yī)院收治的酒精性肝炎病人98例為觀察組，選取同時(shí)間段綿陽市第三人民醫(yī)院體檢中心體檢的健康志愿者89例為健康對照組。觀察組男81例、女17例，年齡（45.26±8.46）歲，范圍為33～68歲，體質(zhì)量指數(shù)（22.14±2.16）kg/m2，范圍為17.65～27.85 kg/m2，其中有27例并發(fā)酒精性肝硬化，肝硬化代償期20例、失代償期7例，其中初診21例，所有病人均接受常規(guī)保肝、護(hù)肝治療；健康對照組男76例、女13例，年齡（46.75±9.05）歲，范圍為30～70歲，體質(zhì)量指數(shù)（22.16±2.14）kg/m2，范圍為17.61～27.89 kg/m2。兩組性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組均符合《酒精性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)》中酒精性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，健康對照組均為健康志愿者；②均檢測外周血血清miR-182和miR-30e水平；③均對本研究知情同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤等其它類型肝病者；②合并乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤者；③存在其它類型可能與miR-182和miR-30e異常表達(dá)有關(guān)的疾病者，如視力、聽力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等；④存在認(rèn)知、精神、溝通等方面障礙者。

1.3 血清miR-182和miR-30e水平檢測（1）試劑和儀器：美國Beckman Coulter公司Avanti型臺式離心機(jī)、日本三洋公司MDF-U54V型醫(yī)用超低溫冰箱，美國Invitmgen公司miR easy Mini kit試劑盒，美國GeneCopoeia公司miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Bio-Rad公司SC46-T100型PCR儀；（2）檢測方法：取外周血各5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80℃的醫(yī)用超低溫冰箱中。利用miR easy Mini kit試劑盒抽提血清RNA，并采用miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，合成相應(yīng)的Taqman熒光探針。以PCI儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中miR-182引物序列正向引物：GCGCTGCTAGACTCTCTGAAT，反向引物：GCTCGATAGCTATTAGCTATAGCTA；miR-30e引物序列正向引物：CGATATAGACTAGCTAGAGAGCTAG，反向引物：CGTGATAGAGAGCTAGAGCGCGCGATAGC，內(nèi)參為U6，引物均根據(jù)GenBank人類信息利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，委托寶生物（大連）科技有限公司合成。反應(yīng)條件：95℃10 min（預(yù)變性）、95 ℃20 s（變性）、58 ℃60 s（退火）、72 ℃40 s（延伸），40個(gè)循環(huán)。繪制PCR曲線，得到Ct值，即熒光強(qiáng)度達(dá)到的閾值所需的循環(huán)數(shù)，待測基因的相對表達(dá)量計(jì)算方法：2-△△Ct。

1.4 觀察指標(biāo)比較觀察組與健康對照組及觀察組中未并發(fā)酒精性肝硬化、并發(fā)酒精性肝硬化、酒精性肝硬化代償期、酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理以SPSS 25.0軟件，采用±s描述計(jì)量資料，兩獨(dú)立樣本間均數(shù)的比較采用成組t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比觀察組血清miR-182和miR-30e水平均低于健康對照組（P<0.05），見表1。

表1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

表1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

組別健康對照組觀察組t值P值例數(shù)89 98 miR-182 0.65±0.12 0.21±0.04 34.27<0.001 miR-30e 1.58±0.25 0.41±0.08 43.93<0.001

2.2 觀察組中是否并發(fā)酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比觀察組中并發(fā)酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平均低于未并發(fā)酒精性肝硬化病人（P<0.05），見表2。

表2 觀察組中是否并發(fā)酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

表2 觀察組中是否并發(fā)酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

并發(fā)肝硬化是否t值例數(shù)27 72 P值miR-182 0.13±0.03 0.24±0.05 10.71<0.001 miR-30e 0.29±0.04 0.45±0.10 8.06<0.001

2.3 并發(fā)酒精性肝硬化代償期、失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平對比并發(fā)酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平均低于代償期病人（P<0.05），見表3。

表3 并發(fā)酒精性肝硬化代償期、失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

并發(fā)酒精性肝硬化失代償期代償期t值P值例數(shù)7 20 miR-182 0.06±0.02 0.15±0.04 5.66 0.000 miR-30e 0.13±0.03 0.35±0.05 10.89 0.000

3 討論

酒精性肝炎主要由于長期過量飲酒所致，且與個(gè)體對乙醇的敏感性有關(guān)。研究指出[7-9]，長期飲酒不僅可引起肝臟內(nèi)良性脂肪堆積，還可增加肝組織鐵負(fù)荷量，引起機(jī)體防御機(jī)制失調(diào)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，誘發(fā)炎癥和纖維環(huán)，在“初次打擊”和“二次打擊”的作用下可導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)損害，損傷肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。酒精性肝炎病人若得不到及時(shí)診治，可發(fā)展為酒精性肝硬化，增加死亡幾率，尤其是在酒精依賴、成癮病人中酒精性肝硬化和死亡的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均更高[10]。但目前人們對酒精性肝炎及酒精性肝硬化的發(fā)生和發(fā)展認(rèn)識尚淺，而miR在此類疾病中的異常表達(dá)及作用機(jī)制雖有少量報(bào)道，也仍需要繼續(xù)深入探討。

miR-182已均被證實(shí)在原發(fā)性肝癌病人中表達(dá)水平偏低，且與病情程度、肝功能均有密切關(guān)系[11]。miR-182可以與靶基因的啟動子、5’UTR結(jié)合發(fā)揮作用，其作用復(fù)雜，且基因簇也很多，在細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、代謝和凋亡過程中均積極參與且發(fā)揮重要的作用。有研究顯示[12]，慢性低濃度酒精攝取可以下調(diào)小鼠小腦miR-182的表達(dá)水平，且可引發(fā)酒精依賴，并誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)損害，甚至可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，推測該基因表達(dá)有助于位置神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能，而長期過量飲酒可通過下調(diào)該基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)炎癥性損傷。因此miR-182在酒精性肝炎病人中的表達(dá)水平也可能顯著下調(diào)，且參與肝臟結(jié)構(gòu)與功能的損害，影響肝功能，但是其作用機(jī)制均尚未清楚，仍需深入探討和挖掘。本研究中觀察組血清miR-182的水平明顯低于健康對照組，提示酒精性肝炎病人中血清miR-182水平較低。此外，本研究中還顯示并發(fā)酒精性肝硬化病人的血清miR-182水平低于未并發(fā)病人，且失代償期病人血清miR-182水平低于代償期病人，可知酒精性肝炎病人血清miR-182水平很可能與疾病發(fā)展有關(guān)，推測很可能是長期過度飲酒導(dǎo)致miR-182表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，且其水平表達(dá)水平越低，肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)性損傷越嚴(yán)重，肝功能損害也越嚴(yán)重，故而并發(fā)酒精性肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)越高，病情進(jìn)展也越快。

miR-30e是miR-30的一個(gè)重要成員，可通過堿基互補(bǔ)配對方式與靶基因相結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化與凋亡，最終可實(shí)現(xiàn)調(diào)控機(jī)體生長發(fā)育和代謝的作用[13]。miR-30e在心血管系統(tǒng)、代謝性疾病以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中均扮演著重要的角色，其主要作用機(jī)制有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控脂肪細(xì)胞形成等，在炎癥反應(yīng)病理改變中也發(fā)揮著重要的作用[14]。有研究顯示[15]，miR-30e可協(xié)同其家族成員共同參與肝臟炎性損傷的發(fā)生和進(jìn)展，在肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌病人中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平顯著下調(diào)。另有研究[16]顯示血清miR-30e低表達(dá)可參與慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展，且其水平越低意味著肝臟損傷越嚴(yán)重，病人的預(yù)后則越差。據(jù)此可以推測miR-30e很可能能夠通過多種途徑參與肝損傷病理改變，在酒精性肝炎發(fā)生及發(fā)展過程中也可能通過影響肝臟內(nèi)脂肪細(xì)胞的形成與積聚、肝細(xì)胞的炎癥性損傷和肝臟的代謝功能等發(fā)揮重要作用。本次研究中觀察組血清miR-30e水平遠(yuǎn)低于健康對照組，提示酒精性肝炎病人血清miR-30e水平普遍偏低。此外，本研究中觀察組并發(fā)酒精性肝硬化病人血清miR-30e水平低于未并發(fā)病人，且酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-30e水平低于代償期病人，可知該指標(biāo)不僅可評價(jià)酒精性肝炎的發(fā)生情況，對是否并發(fā)酒精性肝硬化、酒精性肝硬化的臨床分期判斷也有一定的指導(dǎo)作用，但其中具體的作用機(jī)制仍有待深入探討。

綜上，在酒精性肝炎病人中血清miR-182、miR-30e水平較健康人群偏低，且并發(fā)酒精性肝硬化病人中其水平更低，酒精性肝硬化失代償期其水平也明顯低于酒精性肝硬化代償期病人，二者水平與該病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。但目前人們關(guān)于miR-182、miR-30e異常表達(dá)參與該病發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制認(rèn)識尚淺，仍需深入探討研究，以期為該病的防治提供新的方向。