微小RNA-766-5p通過調(diào)控組氨酸磷酸酶基因表達影響胃癌細胞增殖和放射敏感性

劉國成，官一平，王成，黃國軍

放療是胃癌（gastric cancer）的治療手段之一，可優(yōu)化病人預(yù)后，放療耐受是臨床放療的主要障礙[1]，γ-H2AX含量升高是放療耐受的標(biāo)志之一[2-3]。研究胃癌的放療耐受機制有助于發(fā)現(xiàn)其放療增敏靶點，從而減輕病人痛苦、提高治療效果。

研究表明，miR-766-5p在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，抑制miR-766-5p可抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞凋亡[4]。miR-766-5p在胃癌中的表達尚不清楚。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，組氨酸磷酸酶（phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP）的 3’UTR 區(qū)含有與miR-766-5p互補的序列，LHPP在人宮頸癌組織中表達降低，LHPP過表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[5]。而miR-766-5p和LHPP在胃癌中的表達及胃癌細胞增殖、放射敏感性的影響尚未可知。因此，假設(shè)miR-766-5p可通過靶向LHPP基因影響胃癌細胞的增殖和放射敏感性。

本研究自2019年2―10月通過以不同放射劑量處理胃癌AGS細胞，檢測miR-766-5p和LHPP在AGS細胞中的表達及對AGS細胞增殖和放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人胃上皮細胞GES-1及人胃癌細胞系A(chǔ)GS、MGC803、MKN-28和 SGC-7901購 自 美 國ATCC；LHPP抗體、CyclinD1抗體、γ-H2AX抗體和抗β-actin抗體購自Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司；Total RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）購自寶生物工程（大連）有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物、miR-766-5p模擬物（miR-766-5p）、miR-766-5p抑制劑（antimiR-766-5p）、LHPP干擾物（si-LHPP）、陰性對照（miR-con、anti-miR-c006Fn和 si-con）及 LHPP雙熒光報告質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人胃上皮細胞GES-1及人胃癌細胞系A(chǔ)GS、MGC803、MKN-28和SGC-7901培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在濕度95%、37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長融合為80%時，洗滌，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 收集AGS對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板（密度為1×l06個/毫升），以不轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照（NC）組。細胞融合度達80%時，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行操作，將等體積用無血清培養(yǎng)液稀釋的脂質(zhì)體和各組載體（antimiR-con、anti-miR-766-5p、miR-con、miR-766-5p、sicon和si-LHPP）混合，繼續(xù)培養(yǎng)6h，換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h收集細胞，驗證轉(zhuǎn)染結(jié)果，進行后續(xù)實驗。根據(jù)轉(zhuǎn)染分組：空白對照NC組、anti-miR-con組、anti-miR-766-5p組、miR-con組、miR-766-5p組、antimiR-766-5p+si-con組、anti-miR-766-5p+si-LHPP組。

1.2.3 Real-time PCR檢測RNA的表達 收集人胃上皮細胞GES-1及人胃癌細胞系A(chǔ)GS、MGC803、MKN-28和SGC-7901及轉(zhuǎn)染48 h的AGS細胞，進行總RNA的提取，然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，取cDNA為模板進行Real-time PCR反應(yīng)，合成 LHPP mRNA 和 miR-766-5p。運用 2?ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，以β-actin為內(nèi)參照進行校正。

1.2.4 克隆形成實驗測定放射處理后細胞存活分數(shù) 取轉(zhuǎn)染后各組AGS細胞，接種于6孔板（1×104個細胞/孔），培養(yǎng)24 h，將細胞在射劑量為0、2、4、6、8 Gy進行照射處理，照射條件為37℃，照射面積10 cm×10 cm，靶距100 cm。照射后每組取500個細胞接種于培養(yǎng)皿中，加入10 mL培養(yǎng)液混勻，培養(yǎng)2周，至出現(xiàn)肉眼清晰可見的細胞克隆，棄培養(yǎng)液并洗滌細胞，4%冷甲醛固定細胞20 min，結(jié)晶紫染色30 min，晾干后計數(shù)，以所形成的細胞集落>50個為有效菌落。根據(jù)GraphPad Prism5單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，計算放射增敏比（SER）。計算細胞克隆形成率=（細胞克隆數(shù)平均值/接種細胞總數(shù)）×100%，細胞存活分數(shù)（survival fraction，SF）=受照射細胞克隆形成率/對照細胞克隆形成率）×100%。

1.2.5 MTT法測定細胞存活率 收集各組對數(shù)生長期的AGS細胞，接種于96孔板中（1×103個細胞/孔），以不加細胞的培養(yǎng)液為空白對照，72h后每孔加入20 μL MTT，培養(yǎng)4 h棄培養(yǎng)上清，每孔再加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀測定490 nm 吸光度（A）值。細胞存活率=（A實驗組－A空白對照組）/（A陰性對照組－A空白對照組）×100%。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 RIPA裂解液加入GES-1細胞和各組胃癌細胞，收集蛋白，測定總蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液（LHPP抗體1∶800、CyclinD1抗體1∶1 000、γ-H2AX抗體1∶1 000、β-actin抗體1∶2 000），4 ℃孵育過夜，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進行兩組間的比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞系中miR-766-5p和LHPP的表達與GES-1相比，miR-766-5p在胃癌細胞AGS、MGC803、MKN-28、SGC-7901表達量均顯著上升（P<0.05），LHPP mRNA和蛋白的表達量顯著下降（P<0.05），見表1。后續(xù)實驗選擇AGS細胞進行研究。

表1 胃癌細胞系中miR-766-5p和LHPP的表達/±s

表1 胃癌細胞系中miR-766-5p和LHPP的表達/±s

注：①與GES-1細胞組比較，P<0.05。

組別GES-1 AGS MGC803 MKN-28 SGC-7901 F值P值LHPP protein 1.08±0.12 0.45±0.05①0.35±0.05①0.30±0.04①0.46±0.05①63.68 0.000重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 miR-766-5p 1.00±0.10 3.30±0.24①2.89±0.19①2.05±0.21①1.99±0.19①64.89 0.000 LHPP mRNA 4.46±0.25 0.85±0.09①1.01±0.11①0.75±0.08①0.99±0.10①385.37 0.000

2.2 轉(zhuǎn)染anti-miR-766-5p抑制胃癌細胞系A(chǔ)GS增殖與NC組相比，anti-miR-766-5p組細胞中miR-766-5p表達量降低（P<0.05），LHPP mRNA和蛋白表達量顯著上升（P<0.05），CyclinD1表達降低（P<0.05），γ-H2AX表達增多（P<0.05），細胞存活率顯著下降（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明抑制miR-766-5p表達可抑制AGS細胞增殖。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染anti-miR-766-5p對AGS胃癌細胞增殖和相關(guān)蛋白表達的影響/±s

表2 轉(zhuǎn)染anti-miR-766-5p對AGS胃癌細胞增殖和相關(guān)蛋白表達的影響/±s

注：①與NC組比較，P<0.05。

組別細胞存活率/%重復(fù)次數(shù)miR-766-5p LHPP CyclinD1γ-H2AX NC anti-miR-con anti-miR-766-5p F值P值100.00±5.16 100.03±3.08 63.49±0.06①110.82 0.000 3 3 3 3.38±0.26 3.40±0.25 1.00±0.10①122.32 0.000 0.42±0.05 0.45±0.05 1.12±0.12①72.67 0.000 1.15±0.11 1.13±0.12 0.45±0.05①49.28 0.000 0.85±0.09 0.88±0.09 1.35±0.14①19.77 0.002

2.3 轉(zhuǎn)染anti-miR-766-5p增加AGS細胞放射敏感性與對照NC相比，anti-miR-766-5p組細胞存活分數(shù)隨放射劑量的增加呈下降趨勢，放射增敏比為1.72。見表3。說明抑制miR-766-5p表達可提高胃癌AGS細胞的放射敏感性。

表3 轉(zhuǎn)染anti-miR-766-5p聯(lián)合X射線照射對AGS胃癌細胞作用的單擊多靶模型的參數(shù)值

2.4 miR-766-5p靶向調(diào)控LHPP的表達通過TargetScan對miR-766-5p和LHPP結(jié)合進行預(yù)測顯示，LHPP的3’-UTR序列中含有與miR-766-5p互補的核苷酸序列。

構(gòu)建含有miR-766-5p結(jié)合位點的LHPP-3’UTR野生型及突變型報告基因載體，在AGS細胞中轉(zhuǎn)染miR-766-5p mimics和LHPP野生型及突變型報告基因載體，與miR-con組相比，miR-766-5p組LHPP WT熒光素酶活性降低[（0.40±0.05）比（1.05±0.15），P<0.05]，而突變型MUT熒光素酶活性無變化。與miR-con組相比，miR-766-5p組的LHPP蛋白表達量顯著下降[（0.16±0.03）比（0.45±0.04），P<0.05]；與anti-miR-con組相比，anti-miR-766-5p組的LHPP蛋白表達量顯著上升[（1.10±0.12）比（0.42±0.05），P<0.05]。說明miR-766-5p靶向負調(diào)控LHPP的表達。

2.5 敲減LHPP可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-766-5p對AGS細胞增殖和放射敏感性的影響與對照anti-miR-con組相比，anit-miR-766-5p組AGS的細胞存活分數(shù)隨照射劑量增加逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而且LHPP蛋白表達顯著增多（P<0.05），CyclinD1表達下降（P<0.05），γ-H2AX表達增多（P<0.05），細胞存活率顯著降低（P<0.05），放射增敏比SER為 1.641；與miR-766-5p+si-con組相比，miR-766-5p+si-LHPP組的細胞存活分數(shù)顯著升高（P<0.05），LHPP表達顯著減少（P<0.05），CyclinD1表達上升（P<0.05），γ-H2AX表達減少（P<0.05），細胞存活率顯著上升（P<0.05），放射增敏比SER為0.604，見表4，5。說明敲減LHPP可逆轉(zhuǎn)anti-miR-766-5p對AGS細胞增殖和放射敏感性的作用。

表4 敲減LHPP可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-766-5p對AGS細胞增殖和相關(guān)蛋白的影響/±s

表4 敲減LHPP可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-766-5p對AGS細胞增殖和相關(guān)蛋白的影響/±s

注：①與anti-miR-con組比較，P<0.05。②與anti-miR-766-5p+si-con組比較，P<0.05。

組別anti-miR-con anti-miR-766-5p anti-miR-766-5p+si-con anti-miR-766-5p+si-LHPP F值P值細胞存活率/%100.00±2.46 60.01±1.16①58.97±0.68 89.01±1.16②559.241 0.000重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 LHPP 0.43±0.05 1.12±0.11①1.10±0.11 0.70±0.08②39.21 0.000 CyclinD1 1.10±0.12 0.41±0.05①0.42±0.05 0.89±0.11②45.52 0.000 γ-H2AX 0.83±0.09 1.38±0.14①1.34±0.13 1.05±0.11②14.21 0.000

表5 各組AGS細胞轉(zhuǎn)染處理聯(lián)合X射線照射對AGS胃癌細胞作用的單擊多靶模型的參數(shù)值

3 討論

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其5年生存率約為25%，在確診時4%的病人已發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]。放射抵抗和耐受是癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因，嚴(yán)重威脅病人生存質(zhì)量。γ-H2AX在多種癌癥中表達異常，與輻射導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的修復(fù)有關(guān)，是放療耐受的主要標(biāo)志物之一[7]。

研究表明，miRNA在胃癌中表達異常，以抑癌或致癌的作用影響著胃癌的發(fā)生發(fā)展，在臨床中具有診斷和預(yù)后標(biāo)志物及化療工具等作用[8]。miR-766-5p在結(jié)直腸癌組織中含量顯著高于正常組織，抑制其表達可靶向癌細胞侵襲抑制因子（SCAI）抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡[4]。miR-766在肝細胞癌組織中表達上調(diào)并與病人預(yù)后有關(guān)，通過靶向NR3C2促進癌癥進展[9]。Wang等[10]通過對多個腫瘤細胞系研究發(fā)現(xiàn)，miR-766通過直接靶向p53抑制因子MDM4來提高p53水平和信號活性，增強了p53介導(dǎo)的細胞周期阻滯和增殖抑制。miR-766-5p在胃癌中的表達和作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-766-5p在胃癌細胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中表達量均顯著上升，提示抑制miR-766-5p表達可抑制胃癌AGS細胞增殖并增強細胞的放射敏感性。另外，本研究通過發(fā)現(xiàn)，LHPP與miR-766-5p存在互補結(jié)合位點，雙熒光素酶報告實驗檢測顯示miR-766-5p可能調(diào)控LHPP的表達。LHPP是無機焦磷酸酶，也是一種蛋白組氨酸磷酸酶和腫瘤抑制因子，在肝細胞癌病人中，LHPP的低表達與腫瘤的嚴(yán)重程度增加和總體生存率降低有關(guān)[11]?；蚪M研究表明，LHPP與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，包括抑郁癥[12]、三陰性乳腺癌[13]、急性淋巴細胞白血病（ALL）[14]。李德馨等[15]最新研究表明，LHPP在低分化胃腺癌中表達下調(diào)，且與腺癌的分化程度相關(guān)。體外和體內(nèi)實驗表明，iDPP/LHPP納米復(fù)合物對黑色素瘤生長有明顯抑制作用，且無明顯不良反應(yīng)[16]。LHPP在膀胱癌組織和細胞中被下調(diào)，促進癌細胞的增殖和生長，LHPP可通過失活A(yù)KT/p65信號通路抑制膀胱癌細胞增殖和生長[17]。本研究結(jié)果表明，LHPP在胃癌細胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中表達量均顯著下調(diào)，與李德馨等結(jié)果一致。進一步的實驗結(jié)果表明，敲減LHPP可逆轉(zhuǎn)抑制miR-766-5p對AGS細胞增殖和放射敏感性的作用，證實了miR-766-5p和LHPP在胃癌細胞中存在調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了在胃癌AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901細胞系中，miR-766-5p表達上調(diào)，LHPP表達下調(diào)。在胃癌AGS細胞中，抑制miR-766-5p可靶向促進LHPP表達，進而增強胃癌AGS細胞的放射敏感性，抑制癌細胞增殖。miR-766-5p是胃癌潛在的放射增敏靶點。

研究還表明，LHPP在宮頸癌組織和細胞系中也低表達，其過度表達可通過抑制AKT的激活降低細胞增殖、遷移和侵襲[5]。在結(jié)直腸癌細胞中過表達LHPP通過PI3K/AKT通路抑制結(jié)直腸癌細胞增殖[18]。在結(jié)直腸癌中下調(diào)miR-766-5p可抑制癌癥進展[9]。因此推測miR-766-5p可能通過PI3K/AKT通路靶向LHPP抑制胃癌并增強其放射敏感性。下一步將研究miR-766-5p和LHPP在胃癌病人樣本中的表達，及對腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲，進一步探討miR-766-5p和LHPP對胃癌臨床診斷和治療中的作用。