利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響

史紀(jì)元，武世勛，王濤，劉時(shí)璋，易智，傅薔

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，已成為人類致殘的主要原因之一[1-3]。炎癥是骨關(guān)節(jié)炎的主要生理病理過程，并且軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞過度生產(chǎn)許多可溶性炎癥介質(zhì)，例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、脂肪因子、前列腺素、白三烯調(diào)節(jié)劑等[4]。鑒于炎癥在骨關(guān)節(jié)炎中的重要作用，新的抗炎療法已經(jīng)廣泛開展，與炎癥有關(guān)的分子是治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶標(biāo)。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是腸內(nèi)分泌L細(xì)胞產(chǎn)生的腸降血糖素激素，GLP-1通過胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R）結(jié)合和誘導(dǎo)來調(diào)節(jié)葡萄糖和能量穩(wěn)態(tài)[5]。GLP-1不僅調(diào)節(jié)血糖水平，而且與炎癥等各種病理生理過程密切相關(guān)。因此，利拉魯肽等GLP-1R激動(dòng)劑對(duì)炎癥相關(guān)疾病的治療具有較高的潛在價(jià)值。Chen等[6]提出用利拉魯肽激活GLP-1R可通過減少炎癥介質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)保護(hù)軟骨細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥。因此，GLP-1R是骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶標(biāo)，而利拉魯肽可能具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。GLP-1R激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）以產(chǎn)生環(huán)狀單磷酸腺苷（cAMP），進(jìn)而激活蛋白激酶A（PKA）和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），從而調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[7-8]。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射單碘乙酸鹽（MIA）會(huì)導(dǎo)致軟骨樣病變的關(guān)節(jié)軟骨喪失，可用于制作嚙齒類動(dòng)物的骨關(guān)節(jié)炎模型[9]。本研究自2019年4―11月探討GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)MIA誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型炎癥反應(yīng)的改善作用，及其對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 GLP-1類似物利拉魯肽購自和諾德（中國）制藥有限公司。用于誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的單碘乙酸鹽（MIA）購自美國Sigma-Aldrich公司。一抗兔抗 GLP-1R、PKA、磷酸化 PKA（Thr197）、CREB、磷酸化CREB（Ser 133）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶4（ADAMTS-4）從英國Abcam公司購買。正常兔抗IgG、兔抗甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司。A/G瓊脂糖蛋白珠購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只成年雄性SD大鼠來自陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（陜）2016-006]，體質(zhì)量為（233.23±14.82）g。將大鼠飼養(yǎng)在溫度為25℃、相對(duì)濕度為55%、光暗周期為12 h的籠中。不限制大鼠飲食。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及給藥 將60只大鼠平均分為模型組、假手術(shù)組和利拉魯肽組，每組20只。在參考文獻(xiàn)所述方法的基礎(chǔ)上做適當(dāng)修改用于建立膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型[10-12]：使用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，在模型組和利拉魯肽組中，將4 mg MIA溶解于40 μL無菌鹽水中并通過大鼠左膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)注入，共處理4周。假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射相同體積的生理鹽水。利拉魯肽組的大鼠在用MIA處理的基礎(chǔ)上，皮下注射 50 μg·kg-1·d-1的利拉魯肽進(jìn)行治療，共4周。模型組和假手術(shù)組大鼠注射相同體積的生理鹽水。給藥結(jié)束后，腹膜內(nèi)注射50 mg/kg戊巴比妥鈉并處死大鼠。收集大鼠左膝關(guān)節(jié)標(biāo)本并分離滑膜組織和軟骨標(biāo)本。

1.2.2 免疫沉淀 收集并研磨大鼠軟骨組織，然后在含有焦磷酸鈉和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中（美國Sigma-Aldrich公司）在冰上裂解30 min。將裂解物以10 000g離心15 min，并收集上清液。將含有等量蛋白質(zhì)的上清液與2.5 mg GLP-1R或正常IgG抗體在4℃下孵育過夜。然后在4℃下使用蛋白A/G瓊脂糖珠進(jìn)行免疫沉淀4 h。然后洗滌珠子，并煮沸5 min使其變性。隨后使用蛋白質(zhì)印跡分析免疫沉淀物。

1.2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 大鼠給藥完成后，分離膝關(guān)節(jié)組織，并制作4 μm厚石蠟切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒根據(jù)說明書進(jìn)行染色。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析 使用包含焦磷酸鈉和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（放射免疫沉淀，北京欣華綠源科技有限公司）提取軟骨組織的總蛋白。根據(jù)制造商的說明，使用二辛可寧酸（BCA）蛋白含量測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白及免疫沉淀物，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜在封閉緩沖液中于室溫孵育2 h，然后在Tris緩沖鹽水和Tween 20（TBST）溶液中洗滌3次（每次5 min），然后與一抗在4℃孵育過夜。將一抗在封閉緩沖液中以1∶2 000的比例稀釋。用TBST洗滌3次（每次5 min）后，將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）抗體在37℃孵育1 h。然后將膜用TBST洗滌3次（每次5 min），并通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行顯影。GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 免疫組織化學(xué)分析 使用免疫組織化學(xué)（IHC）染色評(píng)估各組的GLP-1R表達(dá)水平。將軟骨組織制備4 μm厚石蠟切片，3%過氧化氫（H2O2）封閉10 min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min，然后將切片脫蠟并復(fù)水。將切片與兔抗GLP-1R（1∶500）在4℃孵育過夜，并在37℃與山羊抗兔二抗孵育1 h。將切片在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）緩沖液中洗滌3次，然后在3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液中孵育3 min。蘇木精用于復(fù)染細(xì)胞核。使用光學(xué)顯微鏡觀察圖像，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，使用積分吸光度值表示GLP-1R的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0軟件用于數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)資料為計(jì)量資料，以±s描述，組間比較使用單因素方差分析（ANOVA）及兩兩比較Tukey檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立建模后解剖大鼠膝關(guān)節(jié)，如圖1所示，對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)正常。建模組大鼠關(guān)節(jié)明顯腫大，軟骨明顯變黃，表面粗糙，表明建模成功。如圖2所示，HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)組織未見明顯病理改變。模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨層存在明顯的缺損，表層可見炎性細(xì)胞浸潤，軟骨下層血管增生明顯并伴有大量結(jié)締組織滲透。而利拉魯肽組大鼠關(guān)節(jié)病變程度明顯減輕。

2.2 利拉魯肽對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響在用利拉魯肽處理21 d和28 d后，利拉魯肽組大鼠的體質(zhì)量明顯低于其他組[21 d：對(duì)照組（282.13±12.32）g、模型組（280.22±11.24）g、利拉魯肽組（264.18±12.76）g；28 d ：對(duì)照組（292.89±10.64）g、模型組（290.14±16.13）g、利拉魯肽組（273.54±15.33）g；P<0.05]，而模型組和假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說明利拉魯肽給藥可能導(dǎo)致機(jī)體體質(zhì)量減輕。

2.3 利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織GLP-1R表達(dá)的影響Western blotting檢測(cè)（圖3），與假手術(shù)組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GLP-1R的表達(dá)水平明顯下調(diào)[（1.12±0.11）比（0.34±0.04）]，而利拉魯肽組的GLP-1R蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.87±0.07）明顯高于模型組（P<0.05）。免疫組化結(jié)果（圖4）與Western blotting一致，模型組大鼠的GLP-1R積分光密度明顯低于假手術(shù)組[（548.54±36.54）比（1 042.87±69.43）]，而利拉魯肽組的GLP-1R積分光密度（834.21±53.27）明顯高于模型組（P<0.05）。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GLP-1R的表達(dá)

圖5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA和CREB的磷酸化情況：A為PKA和CREB的磷酸化；B為免疫沉淀蛋白印跡

2.4 利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織PKA/CREB信號(hào)通路的影響結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA和CREB的磷酸化情況均被顯著抑制（P<0.05），然而利拉魯肽處理可顯著提高PKA和CREB的磷酸化水平（P<0.05）（圖5A）。采用免疫沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP-1R參與了PKA/CREB途徑，表明PKA/CREB信號(hào)通路介導(dǎo)利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用（圖5B）。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中aggrecan和collagen Ⅱ的表達(dá)

2.5 利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織aggrecan和collagen Ⅱ表達(dá)的影響關(guān)節(jié)軟骨主要由蛋白多糖（主要為aggrecan）和collagen Ⅱ組成，本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組[aggrecan）：（1.21±0.07）；collagen Ⅱ：（1.14±0.07）]相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的 aggrecan（0.41±0.03）和 collagen Ⅱ（0.37±0.02）蛋白水平顯著降低（P<0.05）。與模型組相比，利拉魯肽組的aggrecan（1.12±0.07）和collagen Ⅱ（1.02±0.06）蛋白水平均顯著上調(diào)（P<0.05）。見圖6。

圖7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-13和ADAMTS-4的表達(dá)

2.6 利拉魯肽對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥反應(yīng)的影響本研究使用Western blot來檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白 TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-13和 ADAMTS-4的表達(dá)。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的的 TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-13和 ADAMTS-4蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而利拉魯肽處理可顯著抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中上述因子的上調(diào)（P<0.05）。見圖7，表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶4（ADAMTS-4）的表達(dá)水平/±s

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶4（ADAMTS-4）的表達(dá)水平/±s

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組利拉魯肽組F值P值A(chǔ)DAMTS-4 0.45±0.04 1.17±0.11①0.57±0.05①②551.11 0.000重復(fù)次數(shù)9 9 9 TNF-α 0.34±0.03 1.21±0.11①0.59±0.05①②776.65 0.000 IL-1β 0.42±0.04 0.98±0.09①0.53±0.05①②432.95 0.000 IL-6 0.27±0.02 0.85±0.08①0.44±0.04①②635.00 0.000 MMP-13 0.33±0.03 1.04±0.09①0.63±0.06①②604.92 0.000

3 討論

先前的研究表明，炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中起著重要作用，而骨關(guān)節(jié)炎通常與低度滑膜炎密切相關(guān)[13]。此外，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清、早期骨關(guān)節(jié)炎和終末期疾病滑膜中發(fā)現(xiàn)先天免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的細(xì)胞因子如TNFα、IL-6和IL-1β等均明顯上調(diào)[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)了膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的軟骨組織中炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-13和ADAMTS-4的上調(diào)。因此，在骨關(guān)節(jié)炎早期阻斷炎癥途徑可能在一定程度上延緩或抑制疾病的進(jìn)展，這為開發(fā)抗關(guān)節(jié)炎藥物提供了基礎(chǔ)。例如，Ran等人研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方五味子素B可抑制核因子-κB（NF-κB）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路從而成為治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療劑[15]。

炎癥是由許多上游和下游分子介導(dǎo)的。多項(xiàng)研究均證實(shí)GLP-1/GLP-1R可發(fā)揮較好的抗炎功能，它們已被用作炎癥相關(guān)疾病的治療靶標(biāo)。GLP-1是一種腸降血糖素激素，由L細(xì)胞產(chǎn)生，通過與GLP-1R結(jié)合來調(diào)節(jié)葡萄糖和能量穩(wěn)態(tài)[5]。GLP-1R是一種G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布在星形細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞中[5]。Chen等人發(fā)現(xiàn)GLP-1R也在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，并且與軟骨的變性有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中GLP-1R的表達(dá)明顯降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，單碘乙酸酯給藥誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GLP-1R的表達(dá)較低，這說明GLP-1R在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)育中具有潛在作用和關(guān)鍵作用。

前人研究顯示，PKA/CREB信號(hào)通路和相關(guān)的活性成分可能是介導(dǎo)GLP-1/GLP-1R信號(hào)抗炎作用的主要信號(hào)分子[6]。在膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)的軟骨組織中，炎癥相關(guān)蛋白的上調(diào)伴隨著GLP-1R和PKA/CREB通路的下調(diào)。其他研究報(bào)道，GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4可激活PKA[17]。本研究在膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中使用了GLP-1的類似物利拉魯肽來上調(diào)GLP-1R信號(hào)，發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可以通過上調(diào)GLP-1R來激活PKA/CREB途徑并抑制炎癥。據(jù)報(bào)道，CREB與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）家族的成員CREB的結(jié)合蛋白（CBP）結(jié)合，并催化組蛋白乙酰化，從而將染色質(zhì)從閉合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為開放狀態(tài)，這種變化促進(jìn)了RNA聚合酶Ⅱ和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子與開放DNA的結(jié)合并啟動(dòng)抗炎細(xì)胞因子如IL-10和雙重特異性磷酸酶 1（DUSP1）的轉(zhuǎn)錄[18]。這些數(shù)據(jù)表明，CREB信號(hào)的激活在抗炎反應(yīng)中起著重要作用，其中GLP-1R參與了這一過程。

關(guān)節(jié)軟骨是一種膠原纖維構(gòu)成的軟骨，在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起到重要作用，包括減少骨摩擦、潤滑作用、緩沖震動(dòng)、增加關(guān)節(jié)靈活性等。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由蛋白多糖aggrecan和collagen Ⅱ等大分子組成，aggrecan和collagen Ⅱ的降解可直接引起關(guān)節(jié)軟骨組織破壞[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的aggrecan和collagen Ⅱ蛋白水平顯著降低，而利拉魯肽處理的軟骨組織中兩種蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)。說明利拉魯肽對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織具有保護(hù)作用。多項(xiàng)研究證實(shí)，IL-1β可在體外誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中aggrecan和collagen Ⅱ的下調(diào)[21]。MMP-13參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變，其對(duì)collagen Ⅱ具有強(qiáng)大的水解作用[22]。ADAMTS-4是與關(guān)節(jié)疾病相關(guān)的ADAMTS家族聚集蛋白聚糖酶[23]。敲除ADAMTS-4會(huì)減弱由炎癥介質(zhì)引起的軟骨細(xì)胞中aggrecan的降解，從而發(fā)揮骨關(guān)節(jié)保護(hù)作用[24-25]?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究證實(shí)利拉魯肽通過抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥相關(guān)因子的上調(diào)來發(fā)揮軟骨組織保護(hù)作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在單碘乙酸誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，GLP-1R蛋白水平顯著降低，同時(shí)伴隨著PKA/CREB通路的下調(diào)、關(guān)節(jié)軟骨組分aggrecan和collagen Ⅱ的下調(diào)以及炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-13和ADAMTS-4的上調(diào)。本研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1R與PKA/CREB信號(hào)通路存在相互作用，利拉魯肽可以激活PKA/CREB信號(hào)、上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨組分的表達(dá)并抑制炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)共同表明，利拉魯肽在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中具有較好的治療作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)利拉魯肽在治療期間可能引起體質(zhì)量減輕，先前的研究也表明利拉魯肽給藥可導(dǎo)致機(jī)體體質(zhì)量減輕[26]，這可能與其在體質(zhì)量調(diào)節(jié)中的機(jī)制密切相關(guān)。然而，這種體質(zhì)量減輕是否對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠有不良影響還有待進(jìn)一步研究。

（本文圖1，2，4見插圖2-1）