金絲桃苷下調(diào)微小RNA-199a對脂多糖誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞的影響

申玲君，張海瑞，邵偉，馮振霞，鄔超

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺部損傷引起的全身炎性反應(yīng)，其嚴(yán)重時可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)一些中藥和中藥單體防治急性肺損傷效果顯著[2-3]。金絲桃苷是一種重要的天然產(chǎn)物，在各種植物中分布廣泛，金絲桃苷具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心/腦缺血、保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷具有效改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化作用，且其機(jī)制可能與抑制膠原分泌、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]。金絲桃苷能夠抑制肺炎支原體肺炎小鼠的損傷[6]。金絲桃苷可能通過抑制Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）和NOD樣受體蛋3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）通路減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致的急性腎損傷[7]。然而金絲桃苷對急性肺損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。研究表明肺泡上皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤是ALI的病理特點，炎性細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在ALI中發(fā)揮重要作用[8]。本研究自2020年1―5月以人肺泡上皮細(xì)胞（HPAEpiC）為研究對象，探討金絲桃苷對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞的凋亡和炎癥因子影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料HPAEpiC購自上?？道噬锟萍加邢薰?；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LPS購自美國Sigma公司；金絲桃苷購自上海源葉生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）購自上海鈺博生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組人肺泡上皮細(xì)胞HPAEpiC在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在細(xì)胞生長至匯合度為80%左右時，用1 μg/mL LPS處理，作為模型組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；分別用 2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L 金絲桃苷和1 μg/mL LPS處理 HPAEpiC，分別為低、中、高劑量藥物組。

將anti-miR-NC、anti-miR-199a轉(zhuǎn)染至HPAEpiC中，分別為anti-miR-NC組、anti-miR-199a組；將miRNC、miR-199a轉(zhuǎn)染至HPAEpiC后再用10.0 μmol/L金絲桃苷和1 μg/mL LPS處理，分別作為高劑量藥物組+miR-NC組、高劑量藥物組+miR-199a組。

1.3 MTT檢測細(xì)胞增殖在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時，每孔分別加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處檢測吸光度（OD）值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，離心沉淀細(xì)胞，棄上清；然后重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的80%乙醇固定；用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入核糖核酸酶A（RNase A），37℃孵育30 min，加入碘化啶（PI）染色液，4℃染色15 min，上機(jī)檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-199a表達(dá)水平各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計算。miR-199a以U6為內(nèi)參，miR-199a正向引物序列：5'-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'，反向引物序列：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測半胱天冬蛋白酶3（Cleaved-caspase3）、半胱天冬蛋白酶3前體（pro-caspase3）蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次；再加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，在暗室中曝光顯影，定影，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞活力的影響與對照組（0.81±0.04）相比，模型組細(xì)胞OD值（0.35±0.02）降低（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組細(xì)胞OD值[（0.49±0.02）、（0.60±0.03）、（0.72±0.03）]升高，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組（0.36±0.02）相比，anti-miR-199a組細(xì)胞OD值（0.64±0.03）升高（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC（0.72±0.03）相比，高劑量藥物組+miR-199a組細(xì)胞 OD 值（0.42±0.02）降低（P<0.05）。

2.2 金絲桃苷對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞周期的影響與對照組相比，模型組G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-199a組G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC相比，高劑量藥物組+miR-199a組G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低（P<0.05）；各組G2-M期細(xì)胞所占比例無明顯變化（P>0.05）。見表1。

表1 金絲桃苷對HPAEpiC細(xì)胞周期的影響/±s

表1 金絲桃苷對HPAEpiC細(xì)胞周期的影響/±s

注：①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量藥物組相比，P<0.05；④與中劑量藥物組相比，P<0.05。⑤與antimiR-NC組相比，P<0.05。⑥與高劑量藥物組+miR-NC相比，P<0.05。

組別對照組模型組低劑量藥物組中劑量藥物組重復(fù)次S G2-M 33.53±1.00 33.23±0.72 33.30±0.70 33.69±0.43 G0-G1 33.17±1.10 49.20±1.13①46.15±0.80②42.81±0.64②③38.41±0.54②③④49.21±1.19 40.79±0.63⑤33.30±1.27 17.57±0.44①20.55±0.68②23.50±0.47②③28.48±0.50②③④17.54±0.45 26.11±0.61⑤33.11±0.73 33.25±0.69 33.10±0.76 33.06±0.77 32.33±0.65 0.81 0.602高劑量藥物組anti-miR-NC anti-miR-199a高劑量藥物組+miR-NC高劑量藥物組+miR-199a F值P值數(shù) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 38.44±0.51 48.29±0.73⑤⑥135.49 0.000 28.50±0.52 19.38±0.42⑤⑥222.27 0.000

2.3 金絲桃苷對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC凋亡的影響與對照組（8.02±0.32）%相比，模型組細(xì)胞凋亡率（24.20±0.43）%升高（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組細(xì)胞凋亡率[（20.51±0.40）%、（17.67±0.37）%、（12.63±0.32）%]降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組（24.26±0.35）%相比，anti-miR-199a組細(xì)胞凋亡率（14.36±0.29）%降低（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC（12.65±0.32）%相比，高劑量藥物組+miR-199a組細(xì)胞凋亡率（22.09±0.34）%升高（P<0.05）。

2.4 各分組處理對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC炎癥因子的影響與對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組TNF-α、IL-1β水平降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-199a組TNF-α、IL-1β水平降低（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC相比，高劑量藥物組+miR-199a組TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05）。見表2。

表2 各分組處理HPAEpiC中炎癥因子影響/（ng/L，±s

表2 各分組處理HPAEpiC中炎癥因子影響/（ng/L，±s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量藥物組相比，P<0.05。④與中劑量藥物組相比，P<0.05。⑤與antimiR-NC組相比，P<0.05。⑥與高劑量藥物組+miR-NC相比，P<0.05。

IL-1β 101.70±3.77 474.90±6.54①377.49±4.47②329.49±2.30②③242.51±3.85②③④478.18±5.66 274.44±2.39⑤242.03±2.61 427.83±4.78⑤⑥2622.50 0.000組別對照組模型組低劑量藥物組中劑量藥物組高劑量藥物組anti-miR-NC anti-miR-199a高劑量藥物組+miR-NC高劑量藥物組+miR-199a F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 3 3 3 TNF-α 69.43±4.26 411.49±10.02①343.26±5.69②286.83±4.32②③171.55±5.76②③④413.17±7.13 222.58±3.25⑤172.36±4.96 381.13±3.41⑤⑥1348.53 0.000

2.5 各分組處理對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC中miR-199a的影響與對照組（0.96±0.07）相比，模型組miR-199a表達(dá)水平（2.63±0.13）升高（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組miR-199a表達(dá)水平降低[（2.06±0.09）、（1.63±0.08）、（1.28±0.08）]，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組（2.62±0.12）相比，anti-miR-199a組 miR-199a表達(dá)水平（1.19±0.08）降低（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC（1.30±0.09）相比，高劑量藥物組+miR-199a組miR-199a表達(dá)水平（2.21±0.12）升高（P<0.05）。

2.6 各分組處理對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC中Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，模型組Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，pro-caspase3表達(dá)水平降低（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量藥物組Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，pro-caspase3表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-199a組Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，pro-caspase3表達(dá)水平升高（P<0.05）；與高劑量藥物組+miR-NC相比，高劑量藥物組+miR-199a組Cleavedcaspase3表達(dá)水平升高，pro-caspase3表達(dá)水平降低（P<0.05）。見圖1，表3。

圖1 Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白的表達(dá)

表3 各分組處理HPAEpiC中半胱天冬蛋白酶3（Cleavedcaspase3）和半胱天冬蛋白酶3前體（pro-caspase3）蛋白表達(dá)/±s

表3 各分組處理HPAEpiC中半胱天冬蛋白酶3（Cleavedcaspase3）和半胱天冬蛋白酶3前體（pro-caspase3）蛋白表達(dá)/±s

注：①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量藥物組相比，P<0.05；④與中劑量藥物組相比，P<0.05。⑤與antimiR-NC組相比，P<0.05。⑥與高劑量藥物組+miR-NC相比，P<0.05。

pro-caspase3 0.82±0.05 0.21±0.02①0.36±0.02②0.49±0.03②③0.64±0.03②③④0.22±0.02 0.55±0.03⑤0.64±0.04 0.28±0.02⑤⑥146.80 0.000組別對照組模型組低劑量藥物組中劑量藥物組高劑量藥物組anti-miR-NC anti-miR-199a高劑量藥物組+miR-NC高劑量藥物組+miR-199a F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 3 3 3 Cleaved-caspase3 0.13±0.01 0.79±0.05①0.52±0.04②0.38±0.03②③0.24±0.02②③④0.78±0.05 0.33±0.02⑤0.25±0.02 0.63±0.03⑤⑥162.70 0.000

3 討論

急性肺損傷是臨床重大呼吸系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，肺泡炎性細(xì)胞浸潤是其重要病理改變；研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可防治急性肺損傷，研究其發(fā)病機(jī)制可為急性肺損傷臨床治療及藥物研發(fā)提供方向和參考[9-10]。研究報道金絲桃苷能夠保護(hù)過氧化氫誘導(dǎo)的A549細(xì)胞氧化損傷[11]。金絲桃苷可保護(hù)腎臟免于衰老和損傷[12]。金絲桃苷可抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡[13]。金絲桃苷通過激活PPAR-γ可減輕急性肝損傷小鼠和LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中的炎癥[14]。本實驗結(jié)果顯示，低中、高劑量金絲桃苷處理后，LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC中細(xì)胞OD值升高，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞凋亡率降低，TNF-α、IL-1β水平降低，Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，pro-caspase3表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性。表明金絲桃苷可劑量依賴地抑制LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC凋亡和炎癥反應(yīng)。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼RNA，miRNA可能參與其發(fā)病過程，為早期診斷和預(yù)后判斷提供新的思路[15]。miR-199a是一種新型基因調(diào)節(jié)劑，在炎癥和肺損傷中具有重要作用，研究報道LPS可以上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)，miR-199a的下調(diào)可能通過抑制過度的炎癥反應(yīng)和抑制肺組織中細(xì)胞凋亡，減輕敗血癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[16]。SNHG12過表達(dá)通過靶向miR-199a抑制了氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)[17]。本實驗結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC中miR-199a高表達(dá)，抑制miR-199a表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放。與前人研究結(jié)果相符。且本實驗還發(fā)現(xiàn)低中、高劑量金絲桃苷處理后，LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC中miR-199a表達(dá)水平降低，且miR-199a過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金絲桃苷提取物對LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和炎癥因子的作用。

綜上所述，金絲桃苷可能通過下調(diào)miR-199a抑制LPS誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。