江蘇省句容市葡萄炭疽病菌多樣性及對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性分析

許媛,肖婷,褚姝頻,劉吉祥,芮東明,姚克兵,楊敬輝*

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 句容 212400;2.江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站,江蘇 南京 210036)

蘇南丘陵地區(qū)(句容市)鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[1],且種植面積還在不斷增加。根據(jù)句容市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),截至2019 年,全市葡萄種植面積近3 500 hm2,年產(chǎn)量約6萬t。隨著種植面積的增加,葡萄病蟲害的發(fā)生有逐年增加的趨勢,葡萄成熟期也是江南地區(qū)高溫多雨季,葡萄炭疽病發(fā)生嚴(yán)重,已成為當(dāng)?shù)仄咸焉a(chǎn)上的主要病害[2]。

葡萄炭疽病主要發(fā)生在果實(shí)成熟期,腐爛的果實(shí)通常覆蓋著橘色的分生孢子團(tuán)。1891年,美國首次對該病進(jìn)行了報(bào)道[3]。目前,在中國絕大多數(shù)葡萄產(chǎn)區(qū)均有該病害的發(fā)生[4-5]。炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)是一個(gè)廣泛分布于世界各地的植物病原菌屬,對許多大田作物、觀賞植物、經(jīng)濟(jì)作物和藥用植物[6-7]均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。炭疽菌屬真菌能侵入植物的多個(gè)部位(葉、花、莖和果實(shí)),引起果實(shí)腐爛、干梢和枯萎等多種癥狀。各國研究者基于形態(tài)學(xué)或結(jié)合ITS序列分析將C.gloeosporioides和C.acutatum[8]鑒定為導(dǎo)致葡萄炭疽病的病原菌。但有研究表明,C.gloeosporioides和C.acutatum屬于復(fù)合種(species complexes),Weir等[7]認(rèn)為C.gloeosporioides復(fù)合種群包含22個(gè)種和1個(gè)亞種,而C.acutatum復(fù)合種群則包含29個(gè)種[9]。也有研究者利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將葡萄炭疽病菌鑒定為C.gloeosporioides、C.viniferum、C.fructicola、C.aenigma、C.hebeiense和C.citri等[5,10-12]。江蘇省在利用多基因位點(diǎn)檢測葡萄炭疽病菌方面鮮有報(bào)道,僅Yan等[11]檢測出3株C.viniferum,且全部采自常州市。

目前在葡萄病蟲害防控中,化學(xué)藥劑防治仍是葡萄炭疽病的主要防控措施。其中,以苯并咪唑類殺菌劑在葡萄上的應(yīng)用最為廣泛,該類藥劑的抗藥性也在不斷上升[13]。研究表明,苯并咪唑類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生與TUB2基因的點(diǎn)突變有關(guān),點(diǎn)突變導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列發(fā)生改變,TUB2基因中第6、50、167、198、200和240位密碼子的變化均可引起病原真菌田間分離株對苯并咪唑類藥劑的抗性[14]。其中,TUB2基因第198和200位氨基酸密碼子的突變是主要引起炭疽病菌對苯并咪唑類藥劑不同抗性表型的分子機(jī)制,含E198A 突變的菌株表現(xiàn)為高抗,含F(xiàn)200Y突變的菌株則表現(xiàn)為中抗[15]。本研究利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法,鑒定引起句容市葡萄炭疽病的炭疽菌種類,對供試菌株進(jìn)行多菌靈的抗藥性檢測及抗性位點(diǎn)分析,確定句容市不同炭疽菌種群與多菌靈抗藥性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集與分離

從鎮(zhèn)江市句容市華陽鎮(zhèn)、茅山鎮(zhèn)、后白鎮(zhèn)和白兔鎮(zhèn)11個(gè)葡萄園采集葡萄成熟果實(shí)部位的炭疽病樣本,在無菌超凈工作臺(tái)上直接用滅菌牙簽挑取病果表面橘色分生孢子點(diǎn)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,于25 ℃下黑暗培養(yǎng)。產(chǎn)孢后用無菌牙簽將分生孢子從培養(yǎng)皿上刮下,懸浮于1 mL 無菌蒸餾水中,梯度稀釋1 000倍,取100 μL稀釋液涂布15 g·L-1水瓊脂平板,25 ℃黑暗條件下培養(yǎng) 1～2 d,再挑取單個(gè)發(fā)芽的分生孢子于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),即可得到單孢純化后的葡萄炭疽菌孢子。所有菌株采用濾紙片法于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 形態(tài)和培養(yǎng)特征

將-20 ℃冰箱中保存的純培養(yǎng)菌株接種于直徑為90 mm 的PDA平板上活化5 d,用直徑為4 mm的打孔器從新鮮菌絲邊緣打取菌餅,接種于新的PDA平板中央位置,25 ℃黑暗培養(yǎng),每個(gè)菌株3次重復(fù),并于每天同一時(shí)間記錄菌落直徑,連續(xù)記錄7 d,分別計(jì)算各菌株的平均生長速率,觀察記錄菌落形態(tài)特征。吸取10 μL孢子懸浮液置于載玻片上,使用OLYMPUS BX43顯微鏡(Olympus Optical Co.,Ltd.,Japan)在400倍視野下對每個(gè)菌株產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)行形態(tài)觀察,并隨機(jī)選取50個(gè)分生孢子測量其長度和寬度。

1.3 DNA提取及目的基因的擴(kuò)增與測序

1.3.1 菌絲體的收集將待測菌株接種在含有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上,置于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)10 d,用無菌不銹鋼刮勺將菌絲從玻璃紙上刮下,置于2 mL無菌離心管中,50 ℃低溫烘干,再用無菌鑷子將菌絲體充分搗碎即可得到待測菌絲體。

1.3.2 DNA提取與檢測用OMEGA真菌DNA提取試劑盒對51個(gè)單孢分離菌株的基因組DNA進(jìn)行提取,用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳及0.5×TAE緩沖液電泳檢測DNA樣品。

1.3.3 目的基因的擴(kuò)增與測序選擇鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin gene,CAL)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene,GAPDH)、β-微管蛋白基因(β-tublin gene,TUB2)進(jìn)行擴(kuò)增和測序,擴(kuò)增引物及其序列見表1。PCR反應(yīng)體系(50 μL):2×TaqPCR Master Mix 25 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各2 μL,模板 DNA 2 μL,以無菌雙蒸水補(bǔ)足至 50 μL。引物CL1C/CL2C的反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s,57 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。引物GDF1/GDR反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 30 s,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。引物T1/TubR1反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、測序。序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索比對分析。

表1 引物名稱及其序列Table 1 Primers used in this study

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

用BLAST進(jìn)行同源性搜索,將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析,選擇具有高度相似性的序列用于分析。各基因序列按CAL、GAPDH、TUB2的順序相連形成復(fù)合序列,采用MEGA6.06的Clustal W程序?qū)ψ詼y的各個(gè)復(fù)合序列和從GenBank下載的序列(表2)進(jìn)行比對分析,比對后采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 用于系統(tǒng)學(xué)分析的炭疽菌菌株和序列Table 2 Strains and sequences of Colletotrichum spp. used in this study

續(xù)表2 Table 2 continued

1.5 葡萄炭疽病菌對多菌靈的抗性檢測

98.3%多菌靈(Carbendazim)原藥,由江蘇耕耘化學(xué)有限公司提供。藥劑用0.1 mol·L-1的鹽酸配制成10 g·L-1的母液備用。多菌靈的區(qū)分劑量設(shè)置為0、1、5、20、100 mg·L-1。用1 mg·L-1多菌靈作為鑒別敏感(S)或中抗(MR)菌株的區(qū)分劑量,20 mg·L-1多菌靈作為鑒別中抗(MR)或高抗(HR)菌株的區(qū)分劑量[24]。敏感(S)菌株不能在≥1 mg·L-1多菌靈的PDA平板上生長;中抗(MR)菌株不能在≥20 mg·L-1多菌靈的PDA平板上生長;高抗(HR)菌株能在≥20 mg·L-1多菌靈的PDA平板上生長。所有供試菌株均進(jìn)行3次重復(fù)測定。

1.6 抗性位點(diǎn)分析

對TUB2基因進(jìn)行定點(diǎn)擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為TubGF和TubGR(表1),PCR反應(yīng)體系見1.3.3節(jié)。反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定及形態(tài)學(xué)特征

2019年從江蘇省句容市各葡萄產(chǎn)區(qū)采集的病害樣本中分離獲得單孢菌株51株,其中12株來自白兔鎮(zhèn),2株來自后白鎮(zhèn),18株來自華陽鎮(zhèn),19株來自茅山鎮(zhèn)。菌株信息見表3。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析,51株中27株為C.aenigma、16株為C.viniferum、8株為C.fructicola,分離率分別為52.94%、31.37%、15.69%。

表3 從葡萄中分離的炭疽菌菌株Table 3 Colletotrichum strains isolated from grape

圖1是分離后的C.aenigma、C.viniferum和C.fructicola在PDA培養(yǎng)基上生長6 d的菌落形態(tài)。C.aenigma分離菌株的菌落較均勻,從白色到淺橙色、淺灰色,后來變成深綠色,呈棉絮狀(圖1-A)。C.viniferum分離菌株的菌落從白色或灰色到淺橙色、淺棕色,呈棉絮狀,中央有一些鮮橙色的分生孢子團(tuán)(圖1-B)。C.fructicola菌株的菌落較為均勻,由灰白色慢慢變成深綠色,并長有密集的淡灰色氣生菌絲體(圖1-C)。

C.aenigma和C.fructicola菌落在PDA培養(yǎng)基上生長速率的平均值和范圍相似,而C.viniferum生長速率則相對較慢(表4)。C.aenigma菌落的生長速率為11.47～13.9 mm·d-1,平均為(12.78±0.92)mm·d-1;C.viniferum菌落的生長速率為6.37～9.33 mm·d-1,平均為(7.67±1.11)mm·d-1;C.fructicola菌落的生長速率為12.93～13.93 mm·d-1,平均為(13.33±0.41)mm·d-1(表4)。C.aenigma、C.viniferum和C.fructicola的分生孢子幾乎沒有差異,分生孢子均為長卵形或圓柱形,端部鈍圓。C.aenigma的分生孢子平均長、寬分別為(15.34±1.12)μm、(5.93±0.92)μm,C.viniferum的分生孢子的平均長、寬分別為(15.95±1.47)μm、(5.91±0.86)μm,C.fructicola的分生孢子平均長、寬分別為(14.90±1.46)μm、(5.87±0.89)μm(表4)。

表4 C.aenigma、C.viniferum和C.fructicola的形態(tài)特征Table 4 Morphological characterization of C.aenigma,C.viniferum and C.fructicola

2.2 CAL、GAPDH 和 TUB2基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序所得的51株葡萄炭疽菌株的CAL、GAPDH和TUB2基因部分序列用DNASTAR軟件進(jìn)行比對分析后分為3類,每個(gè)類別選擇2株菌株的序列作為代表提交NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得序列號(表2)。將這6株代表菌株和參考菌株(表2)的各基因序列按CAL、GAPDH、TUB2的順序相連形成復(fù)合序列,再進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖2),C.aenigma、C.viniferum和C.fructicola的自距值分別是100%、98%和68%。

圖2 基于Neighbor-joining法構(gòu)建的葡萄炭疽菌CAL、GAPDH 和 TUB2基因序列拼接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Colletotrichum spp. isolates from grapes based on splicing of partial CAL,GAPDH and TUB2 genes sequence

2.3 炭疽病菌對多菌靈的抗性檢測

在獲得的51株分離株中,敏感菌株(S)有27株,中抗菌株(MR)有16株,高抗菌株(HR)有8株,分別占52.94%、31.37%和15.69%。不同種的葡萄炭疽菌對多菌靈的抗性頻率不同,C.aenigma全部為敏感菌株(S),C.fructicola全部為高抗菌株(HR),16株C.viniferum中有2株為敏感菌株(S),其余14株為中抗菌株(MR)(表3)。

2.4 TUB2基因的抗性位點(diǎn)分析

對51株供試菌株的抗性靶標(biāo)基因(TUB2)進(jìn)行分析,8株高抗菌株(HR)的TUB2基因第198位密碼子由GAG(谷氨酸,E)突變成為GCG(丙氨酸,A)即E198A突變;而14株中抗菌株(MR)的TUB2基因第200位密碼子由TTC(苯丙氨酸,F)突變成為TAC(酪氨酸,Y)即F200Y突變;敏感菌株(S)TUB2基因則沒有以上2種突變。

3 討論

關(guān)于炭疽菌復(fù)合體,由于其形態(tài)特征的不穩(wěn)定性,很難準(zhǔn)確識(shí)別出炭疽菌屬物種[6,25]。當(dāng)形態(tài)學(xué)檢測將分離菌株分為6組時(shí),通過多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析實(shí)際鑒定為7種炭疽菌[26]。目前,通過結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育,能對炭疽菌復(fù)合體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[7,9]。

本研究以江蘇省句容市葡萄炭疽病菌為研究對象,利用多基因序列分析結(jié)合形態(tài)特征對其進(jìn)行分類和鑒定,發(fā)現(xiàn)51株葡萄炭疽菌株分別屬于3個(gè)種:C.aenigma、C.viniferum和C.fructicola。其中,C.aenigma和C.fructicola屬于C.gloeosporioides復(fù)合種,而C.viniferum的分類地位還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

C.aenigma的寄主范圍很廣,Weir 等[7]最早記載C.aenigma的寄主為沙梨和鱷梨,此外還包括蘋果、辣椒、草莓、茶葉等,在全球均有分布[20,27-29]。Yan 等[11]最先在中國北京、河北和陜西等地發(fā)現(xiàn)C.aenigma危害葡萄。此前江蘇省尚未見相關(guān)報(bào)道,這是首次發(fā)現(xiàn)C.aenigma是引起江蘇省葡萄炭疽病的病原菌。C.viniferum最早在中國云南和貴州的葡萄上發(fā)現(xiàn)并命名[10],后來在北京、河北、山東、江蘇、新疆、福建等地也相繼發(fā)現(xiàn)了能夠侵染葡萄的C.viniferum[11],目前在日本和韓國[30-31]也有相關(guān)報(bào)道。2019年,He等[28]在中國山東的核桃和草莓上也分離到了C.viniferum,說明C.viniferum除了能夠侵染葡萄,也能夠侵染其他植物。筆者采集的51株葡萄炭疽病菌菌株中,31.37%為C.viniferum。結(jié)合相關(guān)報(bào)道[10-12],說明C.viniferum在中國普遍存在,且出現(xiàn)的頻率高,由此推測C.viniferum很可能是中國葡萄炭疽病菌的優(yōu)勢種。目前該種僅在亞洲國家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,是不是該種是亞洲地區(qū)所特有的種,還有待進(jìn)一步確認(rèn)。C.fructicola無論是寄主范圍還是地理分布都非常廣泛,目前已在多個(gè)國家的多種植物上分離到:泰國的咖啡、加拿大的草莓、以色列的勿忘我、尼日利亞的紫薯、巴西的芒果、日本的蘋果、美國的桃、中國的茶樹、新西蘭的鱷梨等[7,10,16,20]。Peng等[10]首次在中國貴州省發(fā)現(xiàn)C.fructicola能夠引起葡萄炭疽病,而在江蘇省這是首次發(fā)現(xiàn)C.fructicola是葡萄炭疽病的病原菌。

不同的炭疽菌種類在對相同殺菌劑的反應(yīng)上可能表現(xiàn)出顯著的差異。Han等[32]發(fā)現(xiàn)由C.aenigma引起的草莓炭疽病均對多菌靈敏感,而由C.fructicola引起的山藥炭疽病中不僅有敏感菌株,同時(shí)也有中抗和高抗菌株;Yokosawa等[30]則發(fā)現(xiàn)在日本長野縣,由C.viniferum引起的葡萄炭疽病菌對嘧菌酯和苯菌靈全部表現(xiàn)為敏感,而由C.fructicola引起的葡萄炭疽病菌對這2種藥劑則全部表現(xiàn)為抗性。本研究中,不同種群的葡萄炭疽病病原菌與苯并咪唑類抗藥性也有著強(qiáng)烈的對應(yīng)關(guān)系:C.aenigma分離菌株全部對多菌靈敏感,C.fructicola分離菌株全部對多菌靈高抗,而C.viniferum分離菌株中既有敏感菌株(S),又有中抗菌株(MR)。在此前,未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道C.viniferum菌株會(huì)對多菌靈產(chǎn)生抗藥性。

綜上所述,本研究利用CAL、GAPDH和TUB2基因的部分序列結(jié)合形態(tài)學(xué)研究方法對采自江蘇省句容市的51株葡萄炭疽病菌進(jìn)行種類多樣性分析,明確了該病菌僅在市域范圍內(nèi)分布就有豐富的多樣性,有時(shí)是一個(gè)葡萄園里都有不同種同時(shí)侵染為害。通過對多菌靈抗藥性的分析,明確了江蘇省句容市葡萄炭疽種群結(jié)構(gòu)與苯并咪唑類殺菌劑抗藥性之間的關(guān)系。本研究對于進(jìn)一步全面研究各地葡萄產(chǎn)區(qū)的炭疽病病菌種類及抗藥性具有借鑒意義和參考價(jià)值,也可為葡萄炭疽病的準(zhǔn)確診斷、抗性治理提供依據(jù)。