高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法鑒定二丁顆粒的化學(xué)成分

石松安,張瓚,韓靜,韓飛

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110016)

二丁顆粒是由紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍(lán)根4味藥材組成的中藥成方制劑,是清火解毒的常用藥,多用于火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風(fēng)熱火眼等[1]。除了常用的清熱解毒功能外,二丁顆粒還有抑菌抗炎的作用,在臨床上被用于治療急性咽炎和慢性支氣管炎[2-4]。研究表明,秦皮甲素、秦皮乙素是君藥紫花地丁主要活性成分,具有抗炎、抗腫瘤作用[5-7],且秦皮乙素作為二丁顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)收錄于2020年版《中國(guó)藥典》中[1]。表告依春是板藍(lán)根中抗病毒的主要活性成分之一[8-9]。此外,蒲公英中含有的單咖啡酰酒石酸、菊苣酸、咖啡酸和阿魏酸等有效成分具有抑菌、抗炎、抗氧化、保肝利膽等藥理作用,臨床用于治療疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、濕熱黃疸等疾病[10-12]。為了全面闡明二丁顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),有必要開(kāi)展其化學(xué)成分的鑒定研究。

高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(HPLC-FT-ICR-MS)具有極高的分辨率、準(zhǔn)確度和靈敏度,可以提供最可靠的元素組成和分子式,是測(cè)定小分子精確分子量及結(jié)構(gòu)解析的首選方法[13]。本研究采用HPLC-FT-ICR-MS技術(shù)對(duì)二丁顆粒所含的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

1 材料

1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司),AG285型十萬(wàn)分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司),FA2004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司),KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),Solarix 7.0T FT-ICR MS質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司),Data Analysis軟件(德國(guó)Bruker公司)。

L-精氨酸(純度≥98.0%，批號(hào):MKBD3032V)、鳥(niǎo)苷(純度≥98.0%，批號(hào):AJ0609NA14)、L-苯丙氨酸(純度≥98.0%，批號(hào):H02J11H117318)、秦皮乙素(純度≥98.0%，批號(hào):C25J7Y18390)、地奧司明(純度≥95.0%，批號(hào):Y18S6H1)、漢黃芩苷(純度≥98.0%，批號(hào):R27M10F89336)、L-蘋(píng)果酸(純度≥98.0%，批號(hào):S08J12I136815)、原兒茶酸(純度≥98.0%，批號(hào):Z30M6L1)、無(wú)水檸檬酸(純度≥98.0%，批號(hào):SM0425GA14)、秦皮甲素(純度≥98.0%，批號(hào):KA0422CA14)、蘆丁(純度≥98.0%，批號(hào):T20N11Z131674)、類葉升麻苷(純度≥98.0%，批號(hào):W14O10C100217)、金絲桃苷(純度≥98.0%，批號(hào):P12S11F124379)、芹菜素(純度≥98.0%，批號(hào):T30A11F112008)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;蒙花苷(純度：98.0%，批號(hào):AF9081822)、葒草苷(純度：98.0%，批號(hào):AF20091007)、單咖啡酰酒石酸(純度：98.0%，批號(hào):AF20121103)、黨參炔苷(純度：98.0%，批號(hào):AF20051902)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;木犀草苷(純度：99.8%，批號(hào):MUST-15012204)、菊苣酸(純度：99.4%，批號(hào):MUST-15011614)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;木犀草素(供含量測(cè)定用,批號(hào):111520-200201)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;腺苷(純度≥98.0%，批號(hào):FY20141101)購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司)，甲酸(色譜純,成都市科隆化學(xué)品有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

本研究所用的二丁顆粒由修正藥業(yè)集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司提供,批號(hào):200423D,每袋20 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備與前處理

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取L-精氨酸、鳥(niǎo)苷、L-苯丙氨酸、秦皮乙素、地奧司明、漢黃芩苷、L-蘋(píng)果酸、原兒茶酸、無(wú)水檸檬酸、秦皮甲素、蘆丁、類葉升麻苷、金絲桃苷、芹菜素、蒙花苷、葒草苷、單咖啡酰酒石酸、黨參炔苷、木犀草苷、菊苣酸、木犀草素、腺苷對(duì)照品適量,精密稱定,置于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成各對(duì)照品貯備液。精密移取各儲(chǔ)備液適量至同一量瓶中,甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取二丁顆粒2.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中,加入60%乙醇10 mL,稱質(zhì)量,超聲震蕩30 min,放冷至室溫,再次稱質(zhì)量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,12 000 r·min-1離心4 min,上清液采用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾,即得供試品溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kinetex 2.6 μm C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫:0～5 min,5%～10%A;5～10 min,10%A;10～11 min,10%～17%A;11～23 min,17%A;23～33 min,17%～42%A;33～43 min,42%A;43～50 min,42%～55%A;50～55 min,55%A。流速1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)源;正、負(fù)離子掃描模式;質(zhì)量范圍:m/z100～1 500;毛細(xì)管電壓:正離子模式(-4.5 kV)/負(fù)離子模式(4.5 kV);霧化氣(N2)壓力:2.0 bar;干燥氣(N2)流速:6 L·min-1;傳輸毛細(xì)管溫度:220 ℃;掃描次數(shù):1次;離子飛行時(shí)間:0.8 ms;終板補(bǔ)償電壓:-500 V(正離子模式)/500 V(負(fù)離子模式);初始碰撞能:20 V,隨離子動(dòng)態(tài)調(diào)整;數(shù)據(jù)采集系統(tǒng):FTMS Control 2.1,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):Data Analysis 4.4。

2.3 HPLC-FT-ICR-MS法鑒定二丁顆粒的化學(xué)成分

取二丁顆粒樣品,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,二丁顆粒供試品溶液和對(duì)照品溶液分別在正、負(fù)離子2種模式下進(jìn)樣分析,其基峰離子流色譜圖如圖1～2所示。通過(guò)高分辨質(zhì)譜信號(hào)解析、與對(duì)照品及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)[14-18],在二丁顆粒中共表征了106個(gè)化學(xué)成分,其中包含33個(gè)黃酮類、27個(gè)生物堿類、23個(gè)有機(jī)酸類、7個(gè)香豆素類、4個(gè)木質(zhì)素類、3個(gè)倍半萜類、1個(gè)炔類以及8個(gè)其它類型化合物，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間、精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜信息比較,準(zhǔn)確鑒定了22個(gè)化合物,其中黃酮類化合物9個(gè),分別是葒草苷(46號(hào)峰)、蘆丁(67號(hào)峰)、金絲桃苷(70號(hào)峰)、木犀草苷(72號(hào)峰)、地奧司明(87號(hào)峰)、蒙花苷(93號(hào)峰)、木犀草素(95號(hào)峰)、漢黃芩苷(96號(hào)峰)、芹菜素(100號(hào)峰)。生物堿類化合物4個(gè),分別是L-精氨酸(1號(hào)峰)、腺苷(5號(hào)峰)、鳥(niǎo)苷(6號(hào)峰)和L-苯丙氨酸(7號(hào)峰)。有機(jī)酸類化合物6個(gè),分別是L-蘋(píng)果酸(3號(hào)峰)、檸檬酸(4號(hào)峰)、原兒茶酸(8號(hào)峰)、單咖啡酰酒石酸(11號(hào)峰)、類葉升麻苷(74號(hào)峰)、菊苣酸(99號(hào)峰)。香豆素類化合物2個(gè),分別是秦皮甲素(14號(hào)峰)和秦皮乙素(28號(hào)峰)。炔類化合物1個(gè),為黨參炔苷(88號(hào)峰)。

注：A.供試品;B.混合標(biāo)準(zhǔn)品圖1 二丁顆粒供試品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下的基峰離子流色譜圖Fig. 1 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in positive ion mode

注：A.供試品;B.混合標(biāo)準(zhǔn)品圖2 二丁顆粒供試品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在負(fù)離子模式下的基峰離子流色譜圖Fig. 2 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in negative ion mode

表1 HPLC-FT-ICR-MS鑒定的二丁顆粒中化學(xué)成分

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

(續(xù)表三)

2.3.1 黃酮類化合物的質(zhì)譜解析 化合物72保留時(shí)間為18.35 min,在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測(cè)到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z449.107 81(誤差0.07×10-6)和[M-H]-m/z447.093 39(誤差-0.23×10-6),通過(guò)DataAnalysis軟件預(yù)測(cè)其分子式為C21H20O11。在負(fù)離子模式下對(duì)其進(jìn)行碰撞裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z327.051 31 [M-H-C4H8O4]-和m/z285.040 68 [M-H-C6H10O5]-。裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19],經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后,確認(rèn)該化合物為木犀草苷,其裂解方式如圖3所示。

圖3 木犀草苷的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 3 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of luteolin

2.3.2 有機(jī)酸類化合物的質(zhì)譜解析 化合物4保留時(shí)間為1.66 min,在負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下檢測(cè)到其準(zhǔn)分子離子峰 [M-H]-m/z191.019 99(誤差-1.37×10-6),通過(guò)DataAnalysis軟件預(yù)測(cè)其分子式為C6H8O7。在負(fù)離子模式下對(duì)其進(jìn)行碰撞裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z173.009 20 [M-H-H2O]-、m/z129.019 35 [M-H-CO2]-和m/z111.008 79 [M-H-H2O]-。裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20],經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后,確認(rèn)該化合物為檸檬酸,其裂解方式如圖4所示。

圖4 檸檬酸的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 4 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of citric acid

2.3.3 香豆素類化合物的質(zhì)譜解析 化合物28保留時(shí)間為9.61 min,在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測(cè)到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z179.033 90(誤差-0.08×10-6)和[M-H]-m/z177.019 49(誤差-0.86×10-6),通過(guò)DataAnalysis軟件預(yù)測(cè)其分子式為C9H6O4。在負(fù)離子模式下對(duì)其進(jìn)行碰撞裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z133.029 36 [M-H-CO2]-。裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18],經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后,確認(rèn)該化合物為秦皮乙素,其裂解方式如圖5所示。

圖5 秦皮乙素的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 5 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of Esculetin

2.3.4 生物堿類化合物的質(zhì)譜解析 化合物6保留時(shí)間為2.26 min,在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測(cè)到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z284.099 27(誤差-1.13×10-6)和[M-H]-m/z282.084 93(誤差-1.90×10-6),通過(guò)DataAnalysis軟件預(yù)測(cè)其分子式為C10H13N5O5。在正離子模式下對(duì)其進(jìn)行碰撞裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z152.056 09 [M+H-C5H8O4]+。裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21],經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后,確認(rèn)該化合物為鳥(niǎo)苷,其裂解方式如圖6所示。

圖6 鳥(niǎo)苷的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 6 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of guanosine

3 討論

3.1 色譜條件選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相洗脫行為,分別為甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相洗脫時(shí)各成分色譜峰分離度較好,出峰時(shí)間適中;考察了柱溫25、30、35 ℃,發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)分離度、峰形較好。綜上所述,最優(yōu)色譜條件為Kinetex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm);流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 提取條件選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑對(duì)二丁顆粒的提取效率的影響。提取溶劑分別為甲醇[22]、70%甲醇[23]、水、乙醇、60%乙醇[5],發(fā)現(xiàn)以60%乙醇為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取率最高;考察了超聲提取和回流提取2種提取方式,發(fā)現(xiàn)超聲提取效率優(yōu)于回流提取;還考察了不同提取時(shí)間(15、30、45 min)和提取溶劑體積(10、20、30 mL),發(fā)現(xiàn)提取溶劑體積為10 mL,提取時(shí)間為30 min時(shí)各成分基本提取完全。綜上所述,最優(yōu)提取條件為10 mL 60%乙醇超聲提取30 min。

本研究采用HPLC-FT-ICR-MS指認(rèn)出二丁顆粒中106個(gè)化合物,準(zhǔn)確鑒定了其中22個(gè)化合物,推測(cè)了84個(gè)化合物的結(jié)構(gòu),初步闡釋了二丁顆粒的化學(xué)物質(zhì)組成,為其進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。