基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討黃芪多糖對脾虛濕困大鼠小腸黏膜損傷修復(fù)作用機(jī)制

楊彬彬,崔寧,王世軍

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)健康學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

黃芪入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根,列為上品,在我國已有兩千多年的藥用歷史。黃芪味甘、性溫，入肺、脾經(jīng),具補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效,適用于肺脾氣虛,輸布失常,脾失運(yùn)化,水濕內(nèi)停之水腫[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等有效活性成分。其中,黃芪多糖的功效主要為增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等[4-6]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,脾虛濕困模型大鼠出現(xiàn)胃腸功能紊亂及小腸黏膜損傷等癥狀,黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)血清胃泌素、淀粉酶、膽囊收縮素(CCK)、血管活性腸肽(VIP)及尿D木糖排泄率等改善胃腸功能,修復(fù)小腸黏膜損傷,但其分子機(jī)制尚不清楚[7-8]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立脾虛濕困大鼠模型,進(jìn)一步觀察黃芪多糖通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對脾虛濕困大鼠的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠60只,體質(zhì)量(150±10)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí)環(huán)境喂養(yǎng),溫度23～25 ℃,相對濕度40%～50%,光照時(shí)間7:00—19:00。按照國家部屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):SDUTCM20201029001)。

1.2 藥物

黃芪多糖(純度：90%，Solarbio公司,貨號(hào):IA0570),4 ℃保存?zhèn)溆谩④甙仔g(shù)散(山西華康藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20181204,6 g×8袋)。

1.3 主要試劑、儀器及飼料

大鼠D-乳酸(D-LA)、二胺氧化酶(DAO) ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,貨號(hào):200107KE6、200107KE7);Wnt1、C-MYC、CyclinD1、β-catenin抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab15251、ab32072、ab40754、ab32572);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):TA-09);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):ZB-2301);qPCR試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa公司,貨號(hào):DRR420B、D9109);PVDF膜、ECL發(fā)光試劑盒(Millipore公司,貨號(hào):IPVH00010、WBKLS0500)。AIN-76A純化飼料、高脂低蛋白飼料購自小黍有泰(北京)生物科技有限公司。

TG16W型微量高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);AC8型洗板機(jī)(Thermo Labsystems公司);352型酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,按照隨機(jī)數(shù)字表法,分為對照組、模型組、黃芪多糖高劑量組、黃芪多糖中劑量組、黃芪多糖低劑量組、參苓白術(shù)散(陽性藥)組,每組10只。除對照組(不作任何處理,正常飼養(yǎng))外,其余各組大鼠按照前期課題組模型制備方法造模,具體造模方法為:大鼠每日飼以高脂低蛋白飼料加力竭游泳,連續(xù)8周,建立脾虛濕困大鼠模型[7-8],并根據(jù)一般狀況評(píng)分判定造模是否成功,見表1。對照組大鼠飼以AIN-76A純化飼料。各組大鼠均自由進(jìn)食、飲水。

表1 脾虛濕困一般狀況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard of general condition of dampness stagnancy due to spleen deficiency

1.4.2 給藥 造模成功后,于造模結(jié)束后次日黃芪多糖高劑量組按照900 mg·kg-1·d-1、黃芪多糖中劑量組按照600 mg·kg-1·d-1、黃芪多糖低劑量組按照300 mg·kg-1·d-1灌胃[9-10];參苓白術(shù)散根據(jù)人和大鼠等效劑量系數(shù)折算大鼠等效劑量為成人日服劑量的6倍,按照2.5 g·kg-1·d-1灌胃[6],每日1次;每100 g體質(zhì)量給予1 mL,連續(xù)2周,對照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃。觀察大鼠一般狀況并記錄大鼠體質(zhì)量變化情況。

1.4.3 標(biāo)本采集 各組動(dòng)物麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置2 h后低溫離心(4 ℃,3 000 r·min-1,10 min,離心半徑10 cm),取血清放置于-20 ℃低溫冰箱中,備用。取空腸組織于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血清D-LA、DAO水平檢測 按照試劑盒說明,采用ELISA法檢測各組大鼠血清D-LA、DAO水平。

1.4.5 小腸推進(jìn)率檢測 脫頸處死大鼠，迅速打開腹腔，摘出小腸，將小腸用生理鹽水潤濕后置于平板上,不加牽引力使其平鋪,分別量取幽門括約肌至色素最前端及幽門括約肌至盲腸距離,以二者之百分比為小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率=小腸內(nèi)色素推進(jìn)距離/全小腸長度×100%。

1.4.6 Western blot法檢測小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá) 取剪切成小塊的小腸組織,勻漿,充分裂解,12 000 r·min-1離心10 min,取上清。BCA法蛋白定量。將提取的蛋白上清加入5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液,混合,95 ℃變性10 min,80 V電壓電泳。60 V電壓轉(zhuǎn)膜,加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液,室溫?fù)u床封閉1 h;將一抗用封閉液稀釋;將封閉后的膜直接放入一抗工作液中,4 ℃反應(yīng)過夜;TBST充分洗滌3次,每次10 min;加入二抗工作液(1∶3 000)中,室溫、避光孵育60 min;TBST充分洗滌3次,每次10 min;采用ECL法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯影,洗片;Image J軟件分析灰度值。

1.4.7 qPCR法檢測小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC的mRNA表達(dá)水平 取小腸組織,根據(jù)RNA試劑盒說明書提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA,合成后測定cDNA濃度,備用。qPCR法檢測小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC的mRNA表達(dá)量,相對定量法計(jì)算各指標(biāo)mRNA的2-ΔΔCt值。引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence

2 結(jié)果

2.1 一般狀況評(píng)分及體質(zhì)量變化

對照組大鼠一般狀況穩(wěn)定,進(jìn)食及飲水量正常,體質(zhì)量穩(wěn)定上升。模型組大鼠自第2周開始出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢,并逐漸出現(xiàn)食欲不振,神倦懶動(dòng)、瞇眼、被毛無光等狀況,一般狀況評(píng)分顯著高于對照組(P<0.01)。黃芪多糖高劑量組及參苓白術(shù)散組一般狀況評(píng)分顯著低于模型組(P<0.01);黃芪多糖高、中劑量組及參苓白術(shù)散組第10周體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05)。見圖1～2。

2.2 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率的影響

與對照組比較，模型組大鼠小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.01);與模型組比較，黃芪多糖高、低劑量組和參苓白術(shù)散組小腸推進(jìn)率明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠一般狀況評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of APS on general condition scores of rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖2 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 2 Effects of APS on body weight of rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖3 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率的影響Fig. 3 Effects of APS on the propulsion rate of the small intes-tine in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

2.3 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠血清D-LA、DAO水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清D-LA、DAO水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較，黃芪多糖高、中、低劑量組，參苓白術(shù)散組D-LA、DAO水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖4。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖4 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠血清D-LA、DAO水平的影響Fig. 4 Effects of APS on serum D-LA, DAO levels in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

2.4 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,黃芪多糖高、中、低劑量組及參苓白術(shù)散組Wnt1、β-catenin、C-MYC蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01),黃芪多糖高、中劑量組CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖5。

2.5 黃芪多糖對脾虛濕困大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖高、中劑量組及參苓白術(shù)散組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。見圖6。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖5 各組大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)的比較Fig. 5 Comparison of protein expressions of Wnt1, β-catenin, CyclinD1 and C-MYC of rats in each group

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖6 各組大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)的比較Fig. 6 Comparison of mRNA expressions of Wnt1, β-catenin, CyclinD1 and C-MYC of rats in each group

3 討論

在中醫(yī)理論中,脾主運(yùn)化的功能包括“化”和“運(yùn)”兩個(gè)方面?！盎敝傅氖瞧阉鹊染⒅镛D(zhuǎn)化成水液,再把水液轉(zhuǎn)化為汗、尿等;“運(yùn)”指的是脾把津液輸布全身。脾虛運(yùn)化不及,不僅可引起營養(yǎng)物質(zhì)的吸收輸布受阻,導(dǎo)致臟腑組織失養(yǎng),也可引起水液的生成轉(zhuǎn)輸障礙,導(dǎo)致水濕內(nèi)停。脾虛時(shí)常表現(xiàn)為食欲不振、脘腹脹悶、大便稀薄等胃腸疾病的癥狀以及腸黏膜屏障損傷,脾胃功能的正常是腸道黏膜屏障功能正常的基礎(chǔ)[11]。

本課題組前期通過模擬飲食失節(jié)加力竭運(yùn)動(dòng)建立脾虛濕困大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)明顯胃腸功能和病理形態(tài)的異常,主要表現(xiàn)為：胃動(dòng)素、胃泌素等水平下降，胃腸動(dòng)力、吸收障礙；十二指腸黏膜缺損、固有層、黏膜下層血管擴(kuò)張充血、出血，黏膜下層漿細(xì)胞浸潤[9]。說明脾虛濕困狀態(tài)下,腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞,影響腸黏膜屏障功能?？梢娪赡c黏膜損傷導(dǎo)致腸道通透性增高,引起腸道細(xì)菌和毒素移位,使得消化吸收功能下降,可能是導(dǎo)致脾虛濕困的機(jī)制之一,研究顯示益氣健脾對于修復(fù)胃腸黏膜損傷具有重要意義[11-12]。

本課題組對黃芪及其各一級(jí)拆分組分健脾祛濕機(jī)制的研究結(jié)果顯示：黃芪能改善脾虛濕困大鼠的一般狀況,調(diào)節(jié)蛋白和脂類代謝,促進(jìn)水液運(yùn)化,糾正胃腸及肝臟形態(tài)和功能的異常;黃芪多糖組分調(diào)節(jié)效果最為明顯,是黃芪健脾祛濕的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。黃芪多糖通過升高模型大鼠血清胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(Gas)等水平,改善脾虛濕困大鼠胃腸功能，幫助胃排空[14]。而MTL作為腦腸肽激素能夠誘發(fā)小腸分節(jié)運(yùn)動(dòng)與胃收縮,還能刺激胃液與胃蛋白酶分泌,幫助食物消化。本實(shí)驗(yàn)中脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率降低,提示出現(xiàn)胃腸功能下降;黃芪多糖能提高模型大鼠小腸推進(jìn)率,提示黃芪多糖具有促進(jìn)胃腸功能的作用,這可能與其升高M(jìn)TL水平有關(guān)。有研究顯示黃芪多糖可加速胃腸黏膜損傷早期修復(fù)過程[15]。

脾虛濕困大鼠十二指腸全基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示[16-17],黃芪多糖能顯著降低脾虛濕困大鼠Wnt1水平。Wnt1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的始動(dòng)因子及控制細(xì)胞生長、增殖的關(guān)鍵分泌信號(hào)分子。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt經(jīng)典途徑,已經(jīng)被證明與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可通過一系列過程使胞質(zhì)內(nèi)大量游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，并與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF4結(jié)合激活下游的c-myc、Cyclin D1等靶基因,從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡過程,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增生性、炎癥性或者腫瘤性病變[18-24]。

有研究發(fā)現(xiàn)黃芪可下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá),延緩大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程,發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用[25]。關(guān)于黃芪多糖是否通過Wnt/β-catenin改善脾虛濕困大鼠胃腸功能，修復(fù)小腸黏膜上皮損傷尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于前期黃芪多糖對于脾虛濕困大鼠胃腸功能紊亂及小腸黏膜損傷修復(fù)研究,進(jìn)一步探討Wnt通路在這一修復(fù)過程中的作用。結(jié)果顯示,脾虛濕困大鼠血清DAO水平升高,提示出現(xiàn)腸黏膜損傷;Wnt通路蛋白Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)異常升高,提示W(wǎng)nt/β-catenin通路異常激活,誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生增生性、炎性病變從而導(dǎo)致了腸黏膜上皮細(xì)胞損傷,因此推測腸黏膜損傷可能與Wnt通路異常激活有關(guān)。而黃芪多糖干預(yù)后,以上Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低,提示黃芪多糖能夠下調(diào)Wnt信號(hào)通路,修復(fù)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷,降低血清DAO水平,從而改善胃腸功能,提高小腸推進(jìn)率,發(fā)揮其益氣健脾祛濕的功效。