茶樹開花相關(guān)基因家族的克隆及CsMFT基因的可變剪切分析

黃 瑞，夏華富，代洪葦，袁連玉，童華榮

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是雙子葉植物山茶屬多年生常綠木本經(jīng)濟植物，起源于中國西南地區(qū)。茶樹葉片和茶樹花分別作為茶樹組織器官和生殖器官在生產(chǎn)和應(yīng)用上起著重要作用，茶樹葉片經(jīng)加工后因其獨特的風(fēng)味和有益健康的特性受到廣泛歡迎，茶樹花也因為其豐富的內(nèi)含成分應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、園藝鑒賞等領(lǐng)域[1]。茶樹生長過程包括營養(yǎng)生長和生殖生長兩種生長狀態(tài)，這兩種狀態(tài)相互競爭水分和營養(yǎng)物質(zhì)[2]。營養(yǎng)生長有益于茶樹葉片的生長發(fā)育，獲取高品質(zhì)的茶葉，生殖生長有益于茶花生長發(fā)育，維持物種多樣性，但生殖生長旺盛消耗茶樹養(yǎng)分抑制營養(yǎng)生長，導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量質(zhì)量下降，降低經(jīng)濟效益[3]。開花誘導(dǎo)是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的開端，研究茶樹成花調(diào)控機理和花芽分化相關(guān)機制有益于調(diào)控茶樹營養(yǎng)生長和生殖生長，提高茶葉和茶樹花的產(chǎn)量和品質(zhì)，為茶葉經(jīng)濟發(fā)展以及良種選育提供依據(jù)。

植物開花是一個受多通路調(diào)節(jié)且連續(xù)、復(fù)雜的過程，植物進入成花誘導(dǎo)階段，經(jīng)信號傳導(dǎo)后再進入成花決定狀態(tài)，開花整合子激活花分生組織相關(guān)基因的表達，進行花芽分化和花器官發(fā)育形成[4]。開花誘導(dǎo)是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要過渡，研究表明植物開花誘導(dǎo)調(diào)控途徑分為5類，分別是光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernilization pathway)、自主途徑(autonomous pathway)、赤霉素途徑(GA pathway)和年齡途徑(aging pathway)[5-6]。其中，光周期、春化途徑與受外界刺激相關(guān)，赤霉素、自主和年齡途徑受到內(nèi)源信號的調(diào)節(jié)[7]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)開花調(diào)控途徑和相關(guān)基因的研究較其他植物更為成熟，F(xiàn)T(FLOWERINGLOCUST)基因和TFL1(TERMINALFLOWER1)基因這一對同源基因最先在擬南芥中被鑒定出來[5]，是擬南芥開花調(diào)控途徑中的關(guān)鍵基因[8]。FT基因與TFL1基因?qū)儆赑EBP基因家族，共同編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein, PEBP)。在被子植物中，PEBP蛋白家族成員既能參與開花過程的調(diào)控，也能參與植物的形態(tài)建成，可分為3個亞家族FT-like、MFT-like和TFL1-like，包括FT(FLOWERING LOCUS T)、TFL1(TERMINAL FLOWER 1)、TSF (TWIN SISTER OF FT)、BFT (BROTHER FT AND TFL1)、 ATC (ARABIDOPSIS THALIANA CENTRORADIALIS)及MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)[9]。研究表明，在擬南芥中AtFT、AtTSF和AtMFT基因促進開花，而AtTFL1、AtATC和AtBFT基因抑制開花[10-13]。

FT基因編碼的FT蛋白是“成花素”的主要構(gòu)成部分，它可通過植物韌皮部被運輸至莖頂端分生組織與FD蛋白作用，形成促使花分生組織表達的復(fù)合體，促進植物開花[14-15]。FT基因是成花調(diào)控多種途徑的關(guān)鍵結(jié)合點，它整合了光周期、春化、赤霉素、自主等途徑的誘導(dǎo)信號，是植物成花過程中重要的整合因子[16]。目前，F(xiàn)T基因在其他植物中也有相關(guān)研究，如小麥(Triticumaestivum)VRN3基因[17]、水稻(Oryzasativa)Hd3a基因[15]、蘋果(Malusdomestica)MdFT1和MdDF2基因[18-19]、番茄(Solanumlycopersicum)SP基因和玉米(Zeamays)ZCN8基因[20]等。TFL1基因與植物營養(yǎng)生長相關(guān)，TFL1基因與FT基因具有高度相似性，但TFL1蛋白與FD蛋白作用，其功能與FT蛋白相拮抗，表現(xiàn)為抑制花原基形成，能夠延遲開花[21-22]。TFS基因與FT基因也具有高相似性，其表達模式和組織表達部位相似，在擬南芥中TSF基因過表達使開花提前，表明TSF基因具有成花誘導(dǎo)作用[23]。MFT基因與FT基因功能相似，有較弱的開花誘導(dǎo)作用，但主要作用是通過赤霉素和脫落酸調(diào)控種子萌發(fā)[4, 24-25]。

可變剪切(alternative splicing, AS)是指不均一核RNA(hnRNA)轉(zhuǎn)錄位點被剪切體選擇性剪切產(chǎn)生不同的mRNA異構(gòu)體的現(xiàn)象[26]。在真核生物中普遍存在可變剪切現(xiàn)象，超過60%的外顯子基因經(jīng)可變剪切后形成不同的轉(zhuǎn)錄本類型，增加了蛋白質(zhì)類型和功能的多樣性[27]?？勺兗羟性谥参锷L中起重要作用，在轉(zhuǎn)錄后對調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育、非生物脅迫的響應(yīng)起作用，有利于植物適應(yīng)環(huán)境和改善植物表型[28]。外顯子跳躍(exon skipping)、內(nèi)含子保留(intron retention)、5′端可變剪接(alternative 5′ splice site) 和 3′端可變剪接(alternative 3′ splice site)是植物中主要的剪切方式[29]。目前，茶樹開花調(diào)控的相關(guān)作用機制尚未完全明確，關(guān)于茶樹開花調(diào)控的相關(guān)基因的報道也較少。本研究鑒定并克隆了茶樹中的5個PEBP基因家族成員，并進行了全面的生物信息學(xué)、啟動子及時空表達特異性分析。并在實驗過程中發(fā)現(xiàn)茶樹CsMFT基因存在2個不同的轉(zhuǎn)錄本，可為進一步研究茶樹開花相關(guān)基因的功能提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究采用的試驗材料為3年生‘南川大茶樹’扦插苗，種植于西南大學(xué)校內(nèi)茶樹種質(zhì)資源圃。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫來源于TPIA數(shù)據(jù)庫(http://tpdb.shengxin.ren/Blast.html)，所用茶樹品種為‘舒茶早’。不同開放程度的茶樹花(花苞、露白、半開、全開、盛開)用于基因表達模式分析，取樣地點為重慶市南川區(qū)，品種為‘南川大茶樹’，液氮速凍后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹開花相關(guān)基因的鑒定及克隆根據(jù)擬南芥中開花相關(guān)基因的研究，在TAIR數(shù)據(jù)庫(http://arabidopsis.org)中下載6個開花相關(guān)基因的序列信息，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中利用本地Blast檢索獲得5個茶樹開花相關(guān)基因。以3年生扦插苗的芽頭、葉片、嫩莖、根部作為材料，品種‘南川大茶樹’通過艾德萊EASY spin 植物RNA快速提取試劑盒，提取其總RNA，用NoVoScript Plus All-in-one 1st strand cDNA Synthesis Super Mix合成第一鏈cDNA。采用Primer3對獲取到的基因CDS序列設(shè)計相應(yīng)的引物(表1)，使用Prime STAR Max DNA Polymer酶進行基因擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢驗后，用TAINgel MiDi Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收相應(yīng)的片段；將回收到的片段連接到pMD18-T載體上，通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌EcoliDH5，挑取單菌落至含AMP抗生素的LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR擴增后將陽性克隆菌液送至生工公司測序。

表1 引物序列信息

1.2.2 生物信息學(xué)分析采用軟件ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)分析茶樹開花相關(guān)基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點，并在 Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)網(wǎng)站上對蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進行分析。分別利用在線軟件SOPM (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive/)對5個茶樹開花相關(guān)基因蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)模型進行分析。采用DNAMAN軟件對茶樹開花相關(guān)基因的氨基酸序列進行多序列比對，并基于鄰接法在MEGA 4軟件中構(gòu)建6個物種(擬南芥、水稻、甜橙、葡萄、楊樹及茶樹)PEBP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過在線軟件MEME(http://memesuite.org/)對茶樹開花相關(guān)基因保守基序的進行分析，其中motif基序最大值設(shè)定10。在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中，獲取茶樹開花相關(guān)基因在茶樹不同組織部位以及在不同逆境脅迫條件下(高鹽、低溫、干旱和外源激素MeJA)的表達水平等數(shù)據(jù)，通過軟件Tbtools制作熱圖。根據(jù)chen[30]構(gòu)建的染色體規(guī)?；蚪M信息，在其文獻中下載染色體規(guī)?；蚪M模型信息，通過基因編號檢索基因在染色體中的位置，獲取染色體起始位點信息，在MAPchart軟件中對基因染色體位置信息進行可視化。在茶樹基因組TPIA中下載茶樹開花相關(guān)基因翻譯起始密碼子前2 kb的啟動子區(qū)域序列，利用在線軟件Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測順式作用元件的類型和數(shù)量，并采用TBtools軟件繪制茶樹開花相關(guān)基因啟動子中的順式作用調(diào)控元件。

1.2.3 基因表達模式分析以不同開放程度的茶樹花(花苞、露白、半開、全開、盛開)為實驗材料，使用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒提取其RNA，以2 μg RNA為模板采用NoVoScript Plus All-in-one 1st strand cDNA Synthesis Super Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍作為熒光定量PCR模板。利用Primer3軟件設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，選用已登錄的TUBA基因為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR方法對其進行表達分析。熒光定量PCR 反應(yīng)體系：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 5 μL，上、下游引物各(10 μmol/L) 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至10 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。試驗進行3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法對基因相對表達量進行計算，采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹開花相關(guān)基因的鑒定及克隆

以模式植物擬南芥中開花相關(guān)基因的序列信息為參考，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中利用Blast檢索功能獲得5個茶樹開花相關(guān)基因，并在基因編碼區(qū)設(shè)計特異性引物(表1)，對5個基因進行克隆，克隆到5個CsPEBP家族基因(圖 1)，其長度均在500 bp左右，分別命名為CsFT、CsATC、CsMFT、CsTFL1和CsBFT。分析結(jié)果顯示：CsTFL1、CsBFT、CsATC和CsMFT基因的核苷酸序列與TPIA數(shù)據(jù)庫中的序列一致， 但CsFT基因的克隆序列與TPIA數(shù)據(jù)庫序列相比缺失了42 bp的序列，可能是因為本研究克隆過程中采用的茶樹品種為‘南川大茶樹’，與TPIA數(shù)據(jù)中使用的‘舒茶早’茶樹品種不同所致。

M. DL2000; 1. CsTFL1; 2. CsFT; 3. CsMFT; 4. CsBFT; 5. CsATC圖1 茶樹開花相關(guān)基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of flowering-related genes in tea plant

2.2 茶樹開花相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 茶樹開花相關(guān)基因的基本信息茶樹開花相關(guān)基因的基本信息和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)如表2所示，5個茶樹開花相關(guān)基因長度為519～525 bp，編碼氨基酸數(shù)目為172～174 aa，蛋白質(zhì)的分子量在19.17～19.64 kD之間，等電點的范圍在7.74～8.93，均為堿性蛋白。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，CsATC、CsMFT、CsBFT定位于細(xì)胞質(zhì)， CsFT定位于細(xì)胞核， CsTFL1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

表2 茶樹和擬南芥中開花相關(guān)基因的基本信息

2.2.2 茶樹開花相關(guān)基因蛋白的系統(tǒng)進化分析根據(jù)擬南芥、水稻、甜橙、葡萄、楊樹及茶樹PEBP家族成員的蛋白質(zhì)序列，用 MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。PEBP蛋白家族可分為MTF-like、FT-like和TFL1-like 3個亞家族，其中，MFT-like亞家族中有7個成員PEBP蛋白，包括茶樹、甜橙、葡萄、楊樹和擬南芥各1個，水稻2個；FT-like亞家族有24個PEBP蛋白，包括水稻13個，甜橙4個，楊樹4個，擬南芥2個和茶樹1個；TFL1-like亞家族有19個PEBP蛋白，其中擬南芥3個，茶樹3個，甜橙3個，楊樹3個，葡萄3個和水稻4個(圖2)。

Cs. 茶樹；Os. 水稻；orange. 甜橙；At. 擬南芥；VIVT. 葡萄；Potri. 楊樹圖2 茶樹與擬南芥等植物中開花相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Cs. Tea plant； Os. Oryza sativa； Orange. Citrus sinensis； At. Arabidopsis； VIVT. Vitis vinifera； Potri. PoplarFig.2 Phylogeny of flowering-related proteins in tea plant and Arabidopsis et al

MTF-like亞家族中茶樹CsMFT與楊樹Potri.015G041000.1、葡萄VIVT01008404001聚為一支；FT-like亞家族中茶樹CsFT與楊樹Potri.008G077700.1、Potri.002G210200.1、Potri.010G179700.1、Potri.010G179900.1和甜橙Orange1.1g035892m聚到一支；TFL1-like亞家族中的CsATC與葡萄的VIVT01036145001，CsTFL1、CsBFT分別與甜橙的Orange1.1g035977m、Orange1.1g030703m聚到同一分支。綜上所述，茶樹中開花相關(guān)蛋白與楊樹、葡萄、甜橙等木本植物的親緣關(guān)系更近，可能具有相似的蛋白功能。

2.2.3 保守基序分析為進一步研究茶樹開花相關(guān)基因序列的特征，分析了5個茶樹開花相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和保守基序組成。茶樹開花相關(guān)基因結(jié)構(gòu)分析顯示(圖3)：此家族5個基因均由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成與擬南芥PEBP基因家族的基因結(jié)構(gòu)相似，此家族基因外顯子長度相似但內(nèi)含子長度差異較大；5個編碼茶樹開花相關(guān)蛋白與擬南芥均含有motif 1～5基序元件，元件順序一致，具有高度的保守性。但茶樹CsFT蛋白序列中多了motif 6和motif 7兩個基序元件，具有獨特的序列特征，推測其可能還具有其他特異性的結(jié)構(gòu)功能。

圖3 茶樹開花相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)和保守基序Fig.3 The gene structure and conservative motif analysis of flowering-related genes in tea plant

2.2.4 基因的染色體定位與蛋白多序列對比茶樹開花相關(guān)基因進行染色體定位分析顯示(圖4)，5個茶樹開花相關(guān)基因分別定位于5條不同的染色體上，CsTFL1基因定位于1號染色體，CsFT基因定位于3號染色體，CsMFT基因定位于15號染色體，CsBFT基因定位于9號染色體，CsATC基因定位于7號染色體。5個茶樹開花相關(guān)基因編碼的蛋白的多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，5個蛋白的氨基酸序列存在高度相似性，其比對結(jié)果的一致性高達72.7%，推測其具有類似的功能，可能存在功能冗余。

圖4 茶樹開花相關(guān)基因的染色定位Fig.4 Chromosome location of flowering-related genes in tea plant

圖中方框為3個保守結(jié)構(gòu)域D-P-D-x-P 、H和G-x-H-R圖5 茶樹開花相關(guān)蛋白的多序列比對The three conserved domains labeled in the figure were D-P-D-x-P, H and G-x-H-RFig.5 Multiple sequence alignment of flowering-related proteins in tea plant

2.2.5 茶樹開花相關(guān)基因家族編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析對該蛋白家族的蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，自由卷曲是該5個蛋白的主要組成成分，所占比例在39.88%～49.07%之間；其次是延長鏈和α螺旋，所占比例為23.15%～27.75%；β轉(zhuǎn)角在蛋白結(jié)構(gòu)中所占的比例最低。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，茶樹CsBFT、CsATC、CsMFT與擬南芥AtMFT蛋白，CsTFL1與AtTFL1、AtBFT蛋白的三級結(jié)構(gòu)均具有高度的相似性，推測其具有相似的生理調(diào)節(jié)功能； 此外，茶樹CsFT與AtFT蛋白三級結(jié)構(gòu)有極大部分的相似性外，還有獨特的結(jié)構(gòu)特征(圖6)，說明茶樹CsFT蛋白可能還具有其他的生物學(xué)功能。

圖6 茶樹開花相關(guān)蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)Fig.6 The secondary and tertiary structure of flowering-related proteins in tea plant

2.2.6 茶樹開花相關(guān)基因的啟動子元件分析為了解茶樹開花相關(guān)基因的作用機制，本研究分析了啟動子順式作用元件(圖7)，5個茶樹開花相關(guān)基因啟動子中均包含有光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件(赤霉素、生長素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸響應(yīng)元件)、逆境脅迫響應(yīng)元件(干旱脅迫響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、創(chuàng)傷響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)相關(guān)元件，防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件)，還有一些與分生組織表達相關(guān)的順式調(diào)控元件、參與細(xì)胞周期調(diào)控元件和參與胚乳表達的順式調(diào)節(jié)元件，其中光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件最多。

圖7 茶樹開花相關(guān)基因啟動子的順式作用元件分析Fig.7 Cis-acting element analysis of the promoter for flowering-related genes in tea plant

2.3 茶樹開花相關(guān)基因的時空表達特異性分析

本研究從茶樹基因組TPIA數(shù)據(jù)庫下載了茶樹開花相關(guān)基因在不同組織的轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)，分析其在生長發(fā)育過程中的功能。CsFT、CsATC、CsTFL、CsBFT基因在大部分組織中表達量都低，但CsMFT基因在茶樹各個部位表達量都高于其他4個基因，且在茶樹芽頭、嫩葉和莖的表達量較高(圖8)，由此推測基因CsMFT在茶樹開花調(diào)控中可能起主要的調(diào)控作用。

顏色代表log2值，紅色代表高表達，藍色代表低表達。下同圖8 茶樹開花相關(guān)基因的組織特異性表達分析The color represents the high (red) and low (blue) expression levels. The same as below.Fig.8 Tissue specific expression of flowering-related genes in tea plant

2.4 茶樹開花相關(guān)基因在非生物脅迫下的表達分析

為探究茶樹開花相關(guān)基因在非生物逆境脅迫下的響應(yīng)機制，本研究還從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA獲取茶樹開花相關(guān)基因在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)并制成熱圖。結(jié)果表明(圖9)，在4種非生物脅迫下茶樹CsFT、CsATC、CsTFL1、CsBFT基因響應(yīng)靈敏度均較低，而茶樹CsMFT基因有較高的表達。在茉莉酸甲酯(MeJA)處理條件下，CsMFT基因經(jīng)外源激素茉莉酸甲酯處理后表達下調(diào)，且在處理24 h時表達量最低。在冷馴化處理條件下，茶樹CsMFT基因表達均受到抑制，CsFT基因表達量有少量上調(diào)。在干旱脅迫條件下，茶樹CsFT基因的表達量隨PEG處理時間的延長表現(xiàn)上調(diào)趨勢，而CsMFT基因的表達量受到抑制。在鹽脅迫下，CsFT基因表達量在NaCl處理72 h有輕微的上調(diào)，而CsMFT基因的表達受到抑制，且隨處理時間的增加抑制程度也增加。推測在茶樹開花相關(guān)基因中，CsMFT基因是主要參與非生物脅迫相應(yīng)過程的基因。

CK、CA1、CA2分別代表未冷馴化處理、完全馴化和去馴化圖9 不同非生物脅迫處理下茶樹開花相關(guān)基因的表達CK, CA1 and CA2 mean non-cold domestication control, complete domestication and de-tamedFig.9 Expression analysis of flowering-related genes under different abiotic stresses in tea plant

2.5 茶樹開花相關(guān)基因花期表達分析

本研究采用熒光定量PCR法分析了基因在不同開放時期的茶樹花中表達情況，結(jié)果顯示(圖10)，CsFT、CsATC基因在整個開花期均呈現(xiàn)高表達，CsTFL1基因在整個開花期的表達量均較低。茶樹CsFT、CsATC、CsMFT基因的表達量均呈現(xiàn)相同水平，即在茶樹花半開時表達量達到最高，并且隨著茶樹花開放時間的推移表達量下降，花盛開時幾乎不表達。推測5個茶樹開花相關(guān)基因是在茶樹花半開時表達量高。

HB. 花苞；LB. 露白；BK. 半開；QK.全開；SK.盛開圖10 不同開花時期茶樹開花相關(guān)基因的表達HB. Bud stage； LB. Initial opening； BK. Half opening； QK. Full opening； SK. BloomingFig.10 Gene expression of flowering-related genes in different flowering periods of tea plant

2.6 CsMFT的可變剪切

在克隆CsMFT基因的過程中發(fā)現(xiàn)有2條帶(圖11)，條帶大小分別在500 bp與750 bp左右，推測此基因可能存在2個不同的轉(zhuǎn)錄本。對這兩條帶進行了測序和比對分析發(fā)現(xiàn)，CsMFT基因(525 bp)與茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中CsMFT基因的序列基本一致，長度與下載序列信息相同，在75、97、416三個位點發(fā)生單堿基變異，但其編碼蛋白序列未發(fā)生變異。689 bp大小的CsMFT基因序列與下載序列信息相比，在581處存在一個單堿基變異(A→G)，在200 bp處多了一段164 bp的基因片段，此基因片段含有7個終止密碼子。經(jīng)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖12)，此增加的片段為第一、二外顯子之間的區(qū)域，并與前后2個外顯子合并形成1個外顯子，屬于內(nèi)含子保留的剪切方式。

M．DL2000圖11 CsMFT基因的可變剪切Fig.11 Alternative splicing of CsMFT gene

圖12 CsMFT基因的可變剪切的結(jié)構(gòu)比較Fig.12 Gene structure of alternative splicing of CsMFT gene

3 討 論

開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵過程，PEBP家族基因參與了植物花器官形成和其他生長發(fā)育過程[31]。目前，已經(jīng)有多種植物的PEBP基因被鑒定，茶樹PEBP基因家族有5個成員，除了CsFT比基因組組裝序列少了42 bp堿基序列外，其余4個基因與基因組TPIA數(shù)據(jù)庫中提供的核苷酸序列一致。CsPEBPs蛋白的空間結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等與擬南芥該家族蛋白類似，具有高度保守性，均含有D-P-D-x-P 基序、80位的his和G-x-H-R 基序等PEBP蛋白家族的特征保守結(jié)構(gòu)[32]。FT與TFL1蛋白質(zhì)序列高度相似，但功能相反，在其他植物中，決定其功能的關(guān)鍵位點在FT蛋白中是Tyr(Y85)，在TFL1蛋白中是His(H88)[33]，在茶樹中CsFT蛋白存在Tyr(Y84)，CsTFL1蛋白中存在His(H85)，因此，茶樹CsFT基因與CsTFL基因具有高度保守性，在茶樹進化過程中并未發(fā)生過多改變。另外，與已報道的擬南芥、辣椒、甘藍、棉花和月季等植物中的PEBP基因結(jié)構(gòu)相同[34-37]，CsPEBPs基因也有4個外顯子和3個內(nèi)含子。與已知其他植物相比，茶樹中該基因家族的成員數(shù)量較少，只有5個，可能是由于茶樹在進化過程中發(fā)生了基因的丟失，并且與同為木本植物的楊樹PEBP家族具有最近的親緣關(guān)系。

植物PEBP基因家族成員的基因表達具有組織表達特異性，同一亞家族基因表達模式相似。棉花GhMFT3D、GhMFT3A和GhFTL2A基因在花瓣或雄蕊中的表達量最高[38]；梨PbFT基因在葉片中表達量最高，其他基因在各個組織中表達量均較低[39]；小麥TaPEBP基因表達水平不同，在同一亞家族內(nèi)，基因具有相似的表達模式[40]；茶樹CsPEBP基因家族成員也具有組織表達特異性，且CsMFT基因的表達量整體高于CsFT、CsTFL1、CsBFT、CsATC，CsMFT基因在茶樹生長中發(fā)揮主要調(diào)控作用。

關(guān)于植物PEBP基因家族的功能研究主要集中在植物開花調(diào)控和形態(tài)構(gòu)建方面[41]。TFL1突變體被認(rèn)為具有早開花和促進末端花分生組織形成的作用[42-43]；CEN(Centroradialis)基因在花序頂端表達，并與FLO(Floricaula)基因相互作用共同調(diào)控花的位置和形態(tài)發(fā)育[44]。FT基因除具有促進開花的作用外，還可參與植物營養(yǎng)生長和貯藏器官分化過程調(diào)控[13, 45]。在花的不同發(fā)育時期，茶樹CsFT基因的表達量均遠(yuǎn)高于其他基因，且在半開和全開時期達到最高，冬棗FT基因在開花期較花苞期的表達量高[46]，說明CsFT基因的開花調(diào)控功能主要作用于花的半開和全開時期。茶樹花期的表達分析中CsMFT、CsFT和CsATC基因有相同表達模式，說明這3個基因可能存在部分功能相同，共同促進茶樹開花。此前，MFT基因被認(rèn)為對種子萌發(fā)有促進作用，同時對促進植物開花也有一定作用[24-25]。本研究中CsMFT基因在芽頭、嫩葉的表達量高于花、果等，且該基因存在可變剪切現(xiàn)象。TFL1基因被認(rèn)為對植物開花起抑制作用[10]，CsTFL1在花期表達分子中幾乎無表達，與其功能預(yù)測相符合。PEBP基因家族還可參與植物非生物脅迫的響應(yīng)過程，但這方面的研究較少。小麥TaPEBP基因的表達對冷、熱、干旱、白粉病、條銹病、麥瘟病等非生物脅迫均有響應(yīng)[47]；青杄PwPEBP在干旱、低溫和高溫下均有明顯響應(yīng)，對鹽脅迫響應(yīng)較低[48]；茶樹5個CsPEBP基因的表達也受到非生物脅迫的影響，其中，CsMFT基因受到鹽、干旱、冷及MeJA等非生物逆境的誘導(dǎo)，基因表達水平高，而CsFT、CsTFL1、CsBFT、CsATC基因的表達水平較低。絕大多數(shù)植物PEBP基因的啟動子都包含光響應(yīng)元件。蘋果MdPEBP基因家族含有較多的光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件[49]；光響應(yīng)元件在棉花GhPEBP家族基因啟動子區(qū)域普遍存在[50]；茶樹CsPEBP基因家族啟動子含有較多的光響應(yīng)元件與激素響應(yīng)元件，均表明其功能與光調(diào)控和激素調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)性較強。

可變剪切廣泛存在于各種植物轉(zhuǎn)錄過程中，是增加基因表達調(diào)控方式的重要途徑之一，有利于植物生長和環(huán)境適應(yīng)[28]。內(nèi)含子保留(IR)出現(xiàn)在植物中頻率遠(yuǎn)高于動物，一些研究認(rèn)為IR現(xiàn)象的發(fā)生是因為不準(zhǔn)確的剪切信號影響剪切效率，在另外的研究中IR也被證實可通過外部刺激觸發(fā)作用于特定發(fā)育階段和組織類型，并呈現(xiàn)性別二態(tài)性[51-52]。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹CsMFT基因存在可變剪切的現(xiàn)象，第一、二外顯子之間的內(nèi)含子部分未被剪切，屬于內(nèi)含子保留(IR)。其中，長度為689 bp的轉(zhuǎn)錄本并不是完整的開放閱讀框(ORF)，在位點285提前終止翻譯，不能夠形成完整的CsMFT蛋白，而長度為525 bp的轉(zhuǎn)錄本可以表達成完整的CsMFT蛋白，該現(xiàn)象的存在在茶樹開花調(diào)控可能起到開關(guān)的作用，本課題組將會繼續(xù)深入研究茶樹中存在該機制的生物學(xué)意義。

綜上所述，本研究克隆了5個茶樹CsPEBP家族基因，并利用生物信息學(xué)的方法全面分析了其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點、組織表達特性及其啟動子元件等信息，用熒光定量PCR的方法分析了CsPEBPs開花過程中的表達特異性。此外，茶樹CsMFT基因存在可變剪切，存在兩個不同長度的轉(zhuǎn)錄本。本研究結(jié)果可為茶樹開花調(diào)控的機理研究提供新思路。