果袋類型對(duì)‘紫金紅霞’葡萄果實(shí)品質(zhì)及花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

王西成，吳偉民，王 博，王壯偉，錢亞明，閆莉春

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

葡萄是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。中國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，葡萄栽培面積和產(chǎn)量分居世界第3和第1位[1]。色澤是果實(shí)外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，更是葡萄果實(shí)成熟程度的重要評(píng)價(jià)依據(jù)，直接決定著葡萄的商品價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。花色苷是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的水溶性色素，是決定葡萄果實(shí)顏色的主要物質(zhì)，可通過苯丙烷代謝途徑和類黃酮途徑合成，存在于表皮細(xì)胞的液泡中，伴隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育與成熟，果實(shí)中花色苷會(huì)逐漸積累，進(jìn)而使葡萄呈現(xiàn)出不同的顏色[2-3]。

花色苷的合成不僅受遺傳因素影響，同時(shí)還受到環(huán)境和理化因素的影響，如光照[4]、溫度[5]、水分[6]、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[7-8]等。遺傳因素決定了花色苷合成的種類和時(shí)期，而環(huán)境因素則會(huì)影響花色苷生物合成的速率和積累量[9-10]。一般認(rèn)為葡萄果實(shí)中花色苷的合成主要包括苯丙氨酸代謝、類黃酮代謝、二氫黃酮醇生成花色素、花色素骨架合成后的修飾，以及花色苷合成后在液泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和匯集5個(gè)階段。而花色苷生物合成相關(guān)基因主要包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，結(jié)構(gòu)基因可編碼直接與花色苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)貯藏相關(guān)的酶，如：苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、查爾酮合成酶基因(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(F3H)、黃烷酮3′羥化酶基因(F3′H)、黃烷酮3′5′羥化酶基因(F3′5′H)、二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)、無色花色素雙加氧酶基因(LDOX)、3-O-類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)、甲基轉(zhuǎn)移酶基因(OMT)等[11]；調(diào)節(jié)基因可控制花色苷生物合成過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空特異表達(dá)，進(jìn)而影響花色苷生物合成的強(qiáng)度和模式，如：轉(zhuǎn)錄因子基因MYB、bHLH等[12-13]。在花色苷合成過程中，充足的光照可促進(jìn)UFGT基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)葡萄果皮中花色苷的合成；而遮光處理則會(huì)抑制UFGT基因的表達(dá)，并最終影響花色苷的合成[14]。MYB是調(diào)控花色苷合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，可在葡萄果皮中特異性表達(dá)[13-14]。枝條環(huán)剝和ABA處理均可通過促進(jìn)MYBA1和MYBA2轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控UFGT基因的上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)花色苷的積累[15-16]。同時(shí)，MYB也可通過與bHLH互作來實(shí)現(xiàn)對(duì)果實(shí)花色苷合成的調(diào)控[17]。

套袋是優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它不僅可以防止昆蟲、鳥類等對(duì)果實(shí)的危害，同時(shí)還可有效阻礙病菌的侵染，大幅降低病果發(fā)生幾率[18]。同時(shí)，套袋還能避免灰塵、農(nóng)藥等對(duì)果實(shí)的污染，保持果面的清潔和果粉的完整，有利于果實(shí)外觀品質(zhì)的提高[19]。此外，由于套袋改變了果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期的溫度和光照條件，因此也會(huì)對(duì)果實(shí)的產(chǎn)量和內(nèi)在品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[20-21]。

目前，有關(guān)套袋對(duì)葡萄果實(shí)著色影響的研究盡管已有報(bào)道，但其影響果實(shí)著色的深層機(jī)理仍不清楚[22-23]。為進(jìn)一步明確果實(shí)套袋對(duì)葡萄果實(shí)中花色苷合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究以‘紫金紅霞’葡萄為試材，考察5種不同類型果袋對(duì)果皮中花色苷合成及相關(guān)基因表達(dá)影響，以期在轉(zhuǎn)錄水平上探討套袋影響葡萄花色苷合成的分子機(jī)理，同時(shí)也為‘紫金紅霞’葡萄生產(chǎn)中果袋的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年6-8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地內(nèi)進(jìn)行。供試材料為長(zhǎng)勢(shì)基本一致的3年生‘紫金紅霞’葡萄，常規(guī)栽培管理。供試果袋包括白色紙袋、無紡布-白紙雙層袋(雙層袋)、綠色紙袋、藍(lán)色紙袋和棕色紙袋。

1.2 材料處理與樣品采集

2020年6月12日，選取生長(zhǎng)發(fā)育相對(duì)較為一致的葡萄進(jìn)行5種果袋套袋處理，不套袋為對(duì)照(CK)。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，單株小區(qū)，每個(gè)處理3株葡萄。分別于套袋后40、50和60 d時(shí)各取樣一次，直至果實(shí)完全成熟。每次從每個(gè)小區(qū)葡萄果穗的上、中、下部位隨機(jī)取樣20粒。樣品采集后分兩部分保存，一部分冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用于單果重、果?？v橫徑、可溶性固形物(total soluble solid, TSS)、可滴定酸(titrate acid, TA)、花色苷含量，以及果實(shí)色澤指標(biāo)的測(cè)定；另一部分用手術(shù)刀片剝?nèi)」ぃ旱賰龊筠D(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果實(shí)品質(zhì)測(cè)定

單果重量用電子天平稱量，果實(shí)的縱徑和橫徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量，據(jù)此計(jì)算果形指數(shù)(縱徑與橫徑的比值)?？扇苄怨绦挝锖坎捎肞AL-1手持式糖度計(jì)(ATAGO)測(cè)定，可滴定酸含量采用酸堿滴定法測(cè)定。葡萄果實(shí)赤道(中緯線)處對(duì)稱4面的果面色澤采用Color Quest XT色差計(jì)Hunter Lab表色系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定[24]，主要包括L*(亮度)、a*(紅綠色差)、b*(黃藍(lán)色差)。然后，進(jìn)一步利用色差計(jì)所測(cè)值計(jì)算出色澤飽和度(chroma，C*)、色調(diào)角(hue angle,h°)和葡萄果實(shí)色澤指數(shù)(color index of red grape,CIRG)。其中，C*=(a*2+b*2)1/2，h°=arctan(b*/a*)，CIRG=(180-h°)/(L*+C*)。葡萄果實(shí)色澤指數(shù)評(píng)價(jià)果實(shí)色澤的標(biāo)準(zhǔn)為：CIRG<2 為黃綠色，26為紫黑色[25]。

1.4 花色苷含量測(cè)定

果皮總花色苷的提取參考Jia等[26]的方法并加以改進(jìn)：分別取不同發(fā)育時(shí)期、不同處理的果皮樣品，液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含1%鹽酸的甲醇溶液，4 ℃黑暗條件中靜置24 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提3次，合并上清液即得果皮總花色苷提取液?；ㄉ蘸康臏y(cè)定參考王小青等[27]的方法進(jìn)行，首先利用分光光度計(jì)分別測(cè)出530和650 nm處的吸光度值D530和D650，然后根據(jù)公式計(jì)算出葡萄果皮中花色苷含量。其中，花色苷含量(mg·g-1)=(D530-0.25×D650)×提取液總體積/0.0462/果皮鮮重。

1.5 基因表達(dá)分析

本研究選擇了部分花色苷合成相關(guān)基因用于表達(dá)分析。總RNA的提取采用上海浦迪生物科技有限公司生產(chǎn)的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行，操作方法參考說明書進(jìn)行，并利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。以總RNA為模板，利用MonScriptTMRTⅢ All-in-One Mix with dsDNase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

Real-Time PCR引物設(shè)計(jì)：MYBA1和CHS1基因引物參考張雷等[22]，F(xiàn)3′H、DFR和LDOX基因引物參考Jeong等[28]，UFGT基因引物參考柳巧禛等[29]，內(nèi)參基因KyActin1引物參考Kobayashi等[12]，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成(表1)。

Real-Time PCR反應(yīng)體系為20 μL：MonAmpTMSYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上游和下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎ?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火+延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)第2步進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取。每個(gè)樣品設(shè)置3 次重復(fù)，相關(guān)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理，以確定目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)曲線等利用Excel 2016軟件進(jìn)行計(jì)算，單因素方差分析使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 果袋類型對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響

由表2可知，隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育與成熟，各套袋處理和對(duì)照葡萄果實(shí)的單果重、縱橫徑和可溶性固形物含量均在逐步增加，而可滴定酸含量則呈逐步下降趨勢(shì)。與同期對(duì)照相比，套袋處理在多數(shù)時(shí)期并未對(duì)果實(shí)單果重、縱橫徑和果形指數(shù)產(chǎn)生較大影響，但隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，不同類型果袋卻對(duì)果實(shí)TSS和TA含量產(chǎn)生了不同程度的影響。其中，套袋40 d時(shí)，各色果袋處理果實(shí)中TSS含量與對(duì)照相比均無顯著變化；在套袋50 d時(shí)，其TSS含量在白色袋、雙層袋和綠色袋處理下與對(duì)照相比仍無顯著變化，而在藍(lán)色和棕色果袋處理下顯著降低；在成熟期(套袋后60 d)時(shí)，雙層袋、綠色袋處理TSS含量與對(duì)照還無顯著差異，而在白色袋、藍(lán)色和棕色袋處理下均比對(duì)照顯著降低，并以藍(lán)色袋降幅最大(19.17%)；而無紡布-白紙雙層果袋和綠色紙袋則未對(duì)TSS含量產(chǎn)生較大影響。果實(shí)TA含量在白色袋、綠色和棕色袋處理40 d，以及雙層袋處理50 d時(shí)均比同期對(duì)照顯著降低，其余套袋處理均與同期對(duì)照無顯著差異；在果實(shí)完全成熟時(shí)(套袋后60 d)，藍(lán)色紙袋處理果實(shí)中TA含量顯著高于對(duì)照，其他果袋處理均未對(duì)TA含量產(chǎn)生顯著影響。

表2 不同類型果袋處理下葡萄果實(shí)品質(zhì)的變化

2.2 果袋類型對(duì)葡萄果實(shí)色澤及總花色苷含量的影響

表3顯示，隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育成熟，套袋處理和對(duì)照果實(shí)的L*值和b*值整體呈逐漸下降趨勢(shì)，而a*值和CIRG值則呈逐步升高趨勢(shì)。與對(duì)照相比，各取樣時(shí)期套袋果實(shí)L*值和b*值均高于同期對(duì)照，且大多達(dá)到顯著水平；與之相反，各取樣時(shí)期套袋果實(shí)a*值和CIRG值則均低于同期對(duì)照，且CIRG值的變化在各時(shí)期均達(dá)到顯著水平?？傮w而言，‘紫金紅霞’葡萄套袋處理有助于果皮亮度L*和黃藍(lán)色差b*值的提高，但卻降低了紅綠色差a*值和果實(shí)色澤指數(shù)CIRG。盡管套袋處理不利于CIRG值的增加，但不同類型果袋間處理也存在一定差異，其中對(duì)CIRG值影響較小的為無紡布-白紙雙層果袋、綠色紙袋和白色紙袋，而藍(lán)色紙袋和棕色紙袋則對(duì)CIRG值影響較大。

表3 不同類型果袋處理下對(duì)葡萄果實(shí)色澤的變化

為進(jìn)一步明確不同類型果袋對(duì)‘紫金紅霞’葡萄果實(shí)著色的影響，本研究對(duì)不同處理果皮中的總花色苷含量進(jìn)行了測(cè)定分析。由圖1可知，隨著葡萄果實(shí)發(fā)育成熟，套袋處理和對(duì)照果皮中總花色苷含量總體均呈逐步增加趨勢(shì)。其中，在套袋后40～50 d時(shí)，套袋處理果皮中總花色苷含量均顯著低于對(duì)照，并以藍(lán)色和棕色果袋處理果皮中花色苷含量最低；在果實(shí)完全成熟時(shí)(套袋后60 d)，除無紡布-白紙雙層袋處理果皮總花色苷含量與對(duì)照樣品之間無顯著差異外，其他套袋處理均比對(duì)照顯著降低，顯著抑制了果皮中花色苷的合成。

圖1 不同類型果袋處理下葡萄果皮中總花色苷含量的變化Fig.1 The total anthocyanin content in grape skin under different types of fruit bagging

2.3 果袋類型對(duì)葡萄果皮中花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR分析結(jié)果(圖2)表明，在葡萄果實(shí)發(fā)育后期(套袋后40、50和60 d)，套袋處理對(duì)果皮中花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用。在套袋后40和50 d時(shí)，除白色紙袋在套袋后40 d時(shí)促進(jìn)了MYBA1基因的上調(diào)表達(dá)外，其他套袋處理對(duì)于相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用。在套袋后60 d時(shí)，不同類型果袋對(duì)果皮中花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響差異較大，其中，白色紙袋促進(jìn)了MYBA1、DFR和LDOX基因的上調(diào)表達(dá)，無紡布-白紙雙層果袋則對(duì)F3′H和UFGT基因的表達(dá)產(chǎn)生了促進(jìn)作用，而綠色、藍(lán)色和棕色果袋對(duì)于相關(guān)基因的表達(dá)仍表現(xiàn)為抑制作用。

圖2 不同類型果袋處理下轉(zhuǎn)錄因子及花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.2 The expression of transcription factors and anthocyanin synthesis related genes under different types of fruit bagbing

3 討 論

果實(shí)套袋是果樹生產(chǎn)中常用的一種栽培管理技術(shù)，由于果實(shí)套袋后其生長(zhǎng)的微環(huán)境發(fā)生了變化，因此會(huì)對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育特性和果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。果實(shí)色澤與果面光潔度是葡萄外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，生產(chǎn)中常通過果實(shí)套袋技術(shù)來提高葡萄的外觀品質(zhì)。然而，不同類型的果袋其效果也存在較大的差異，生產(chǎn)中常根據(jù)葡萄品種的具體特點(diǎn)來選擇使用不同類型的果袋[30]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，盡管在‘紫金紅霞’葡萄果實(shí)發(fā)育過程中不同套袋處理會(huì)對(duì)果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生不同程度的影響，但到果實(shí)完全成熟時(shí)，除白色、藍(lán)色和棕色果袋抑制了果實(shí)中可溶性固形物含量的增高，藍(lán)色果袋阻礙了果實(shí)中可滴定酸含量的降低外，套袋處理并未對(duì)果實(shí)的單果重、縱橫徑、果形指數(shù)等產(chǎn)生顯著影響，這說明套袋不利于‘紫金紅霞’葡萄果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的提升，但對(duì)果實(shí)大小和形狀并不會(huì)產(chǎn)生較大的影響[31-32]。

在花色苷含量方面，5種果袋均對(duì)‘紫金紅霞’葡萄花色苷的合成產(chǎn)生了一定的影響，其中藍(lán)色和棕色果袋對(duì)成熟期果實(shí)中總花色苷合成的影響最為顯著，其次是白色和綠色果袋，而無紡布-白紙雙層袋則未對(duì)成熟期葡萄果皮中的總花色苷含量產(chǎn)生顯著影響。這與果實(shí)色澤分析中，套袋處理果面亮度指標(biāo)L*和黃藍(lán)色差指標(biāo)b*值多顯著高于對(duì)照，而紅綠色差a*值和色澤指數(shù)CIRG值多顯著低于對(duì)照的研究結(jié)果是一致的。究其原因可能在于光照是影響果實(shí)著色的重要因素，充足的光照可通過光合作用為花色苷的合成提供所需的底物，進(jìn)而促進(jìn)花色苷的合成[33-34]。但由于藍(lán)色和棕色果袋透光率偏差，白色和綠色果袋透光率稍強(qiáng)，使得不同類型果袋對(duì)葡萄果皮中花色苷的合成產(chǎn)生了不同的影響；無紡布-白紙雙層袋未對(duì)成熟期果皮中花色苷含量產(chǎn)生顯著影響的原因，可能與果袋透光率和袋內(nèi)溫度雙重環(huán)境因素的變化有關(guān)。

花色苷的合成與積累受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同調(diào)控。已有研究表明，MYBA類轉(zhuǎn)錄因子與果皮中花色苷合成密切相關(guān)[8, 35]，CHS、F3H、DFR、LDOX、UFGT等結(jié)構(gòu)基因也在調(diào)控果實(shí)著色方面發(fā)揮著重要的作用[22, 36]。本研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育后期(套袋后40～60 d)，除白色紙袋外，其他果袋對(duì)MYBA1基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用，這與其他果樹上的研究結(jié)果較為相似[37-38]；對(duì)于結(jié)構(gòu)基因而言，除套袋處理60 d時(shí)白色紙袋促進(jìn)了DFR和LDOX基因的上調(diào)表達(dá)、無紡布-白紙雙層袋促進(jìn)了F3′H、DFR和UFGT的上調(diào)表達(dá)外，其他處理對(duì)于果實(shí)發(fā)育后期相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用，這與總花色苷含量的測(cè)定結(jié)果基本吻合。尤其對(duì)于無紡布-白紙雙層袋而言，成熟期果皮中花色苷含量與對(duì)照間并不存在顯著差異，這可能與F3′H、DFR和UFGT三個(gè)基因在處理果皮中的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，套袋處理未對(duì)‘紫金紅霞’葡萄果實(shí)單果重和果型指數(shù)產(chǎn)生顯著影響，但不利于果實(shí)可溶性固形物含量和果實(shí)色澤指數(shù)的提高；不同類型果袋可通過抑制花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而阻礙果皮中花色苷的合成。套袋處理雖對(duì)果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)和著色產(chǎn)生了一定的不利影響，但卻有利于果面光潔度和整體外觀品質(zhì)的提高。綜合分析認(rèn)為由于無紡布-白紙雙層袋對(duì)成熟期果實(shí)綜合品質(zhì)影響最小，因此可作為‘紫金紅霞’葡萄套袋的優(yōu)先選擇；其次是白色和綠色紙袋；而由于藍(lán)色和棕色果袋對(duì)果實(shí)綜合品質(zhì)產(chǎn)生了較大的不利影響，因此不適用于該品種果實(shí)套袋。