岷江百合WRKY轉錄因子基因的克隆與功能分析

王自娥，鄧 婕，梁婷婷，蘇琳琳，葛 鋒，劉迪秋

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，昆明 650500)

WRKY轉錄因子是植物響應生物和非生物脅迫反應的關鍵調控因子，具有長度約60個氨基酸殘基的WRKY結構域。WRKY結構域高度保守，在N末端包含短肽‘WRKYGQK’，在C末端包含一個CX7CX23-HXC(C2HC)或CX4-5CX22-23HXH(C2H2)鋅指基序[1]。WRKY轉錄因子的DNA結合結構域結合靶基因啟動子中的W-box元件(C/T)TGAC(T/C)，從而激活或抑制靶基因的表達[2-3]。根據WRKY結構域的數(shù)目和鋅指基序的類型可將WRKY轉錄因子家族分為3組：第Ⅰ組包含2個WRKY結構域；第Ⅱ組包含1個WRKY結構域和1個C2H2鋅指基序；第Ⅲ組也只包含1個WRKY結構域，但鋅指基序為C2HC。第Ⅰ組WRKY蛋白可進一步分為2個亞組，Ⅰa含有C2H2鋅指基序，Ⅰb含有C2HC鋅指基序；第Ⅱ組WRKY蛋白則被分為5個亞組(a—e)[4]。WRKY轉錄因子作為植物對多種生物脅迫免疫應答的關鍵調控因子，廣泛參與植物應對多種病原菌的防御反應[5]。植物響應病原菌脅迫時，WRKY轉錄因子對病原菌脅迫呈現(xiàn)出正調節(jié)或負調節(jié)作用。從辣椒(Capsicumannuum)的基因組中分離出了62個WRKY轉錄因子基因，絕大多數(shù)CaWRKY的表達水平在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、辣椒斑駁病毒(pepper mottle virus)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus)和黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)侵染過程中上調[6]。在單胞銹菌(Uromycesvignae)侵染的早期，赤豆(Vignaangularis)VaWRKY33迅速響應并起到正調控作用[7]。在煙草(Nicotianatabacum)中瞬時表達甘蔗(Saccharumspp.)ScWRKY5使煙草對茄腐鐮刀菌(Fusariumsolanivar.coeruleum)表現(xiàn)出更高的敏感性。并且ScWRKY5的瞬時表達導致煙草中超敏反應(hypersensitive response，HR)標記基因NtHSR515及水楊酸(salicylic acid, SA)信號通路相關基因NtPR-1a/c和NtPR2的轉錄水平下降，ScWRKY5通過抑制HR和SA信號通路相關基因的表達負調控甘蔗對茄腐鐮刀菌的抗性[8]。從芍藥(Paeonialactiflora)的轉錄組數(shù)據中篩選了一個差異表達的PlWRKY65基因，通過病毒誘導的基因沉默降低PlWRKY65的表達后，芍藥植株對細鏈格孢(Alternariatenuissima)更加敏感，表現(xiàn)出更嚴重的感染癥狀，且PlWRKY65表達量的下降會導致PlPR2、PlPR4B、PlPR5和PlPR10的表達顯著降低[9]。

百合(Lilium)是世界上著名的鮮切花，深受世界各國人民的喜愛。但是百合容易感染主要由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)引起的枯萎病，枯萎病會導致百合根部腐爛壞死，影響百合的產量和品質，給百合的生產帶來嚴重的經濟損失。岷江百合(L.regaleWilson)為中國特有的野生百合，主要分布于中國四川西部，具有極強的抗真菌、抗病毒特性，是培育百合抗病品種的重要種質資源[10]。前期研究表明過表達岷江百合LrbZIP1、Lr14-3-3、LrGSTU5和LrPR10s等抗病基因的煙草對尖孢鐮刀菌具有較強的抗性[11-14]。通過岷江百合轉錄組測序得到了一系列響應尖孢鐮刀菌侵染的WRKY轉錄因子基因[15]。同時發(fā)現(xiàn)，岷江百合在被尖孢鐮刀菌侵染后WRKY轉錄因子基因LrWRKY4的表達量顯著上調，并在根中大量表達。信號分子SA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、乙烯利(ethephon, ETH)和過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)處理后均能不同程度上調LrWRKY4在岷江百合根中的轉錄水平。因此推測LrWRKY4可能參與岷江百合抗尖孢鐮刀菌的防御反應。本研究分析了LrWRKY4的生物學功能。首先通過在洋蔥(Alliumcepa)表皮細胞中瞬時表達GFP-LrWRKY4融合蛋白，分析其在植物細胞中的表達部位。將LrWRKY4轉入模式植物煙草中過量表達，分析轉基因株系對尖孢鐮刀菌的抗性。同時對JA/SA信號途徑相關基因及部分抗病相關基因在轉基因煙草株系中的轉錄水平進行分析。此外，在岷江百合鱗片中瞬時表達LrWRKY4的RNAi片段，分析LrWRKY4表達量降低對尖孢鐮刀菌抗性和JA/SA信號途徑的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

岷江百合采集于四川省汶川縣，種于昆明理工大學生命科學與技術學院溫室中。用于遺傳轉化實驗的煙草種子由本課題組保存，種子經表面消毒后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)5周后的無菌煙草幼苗用于遺傳轉化實驗。尖孢鐮刀菌由本課題組從具有典型枯萎病癥狀的西伯利亞百合中分離、鑒定和保存，使用前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆與生物信息學分析根據轉錄組測序獲得的LrWRKY4的基因序列設計特異性引物(表1)，通過PCR克隆得到LrWRKY4的開放閱讀框(ORF)，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產物連接到pGEM-T載體(Promega, USA)，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過PCR篩選pGEM-T-LrWRKY4陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序驗證。

將LrWRKY4所編碼的氨基酸序列在NCBI tblastn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件進行同源分析查找相似蛋白。利用ClustalW 1.83軟件對LrWRKY4的氨基酸序列進行多重比對分析；用ExPASY-ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam/)在線軟件分析LrWRKY4的理化性質；用ScanProsite (http://prosite.expasy.org/scanprosite/)在線軟件分析LrWRKY4的結構域。

1.2.2 亞細胞定位以pGEM-T-LrWRKY4為模板，設計帶有BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點的特異性引物(表1)，通過PCR獲得不含終止密碼子的LrWRKY4 ORF。使用BamHⅠ和XbaⅠ對pBIN m-gfp5-ER載體進行酶切，然后通過T4DNA連接酶將LrWRKY4 ORF連接到酶切后的載體中，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過PCR篩選pBIN m-gfp5-ER-LrWRKY4陽性克隆。采用凍融法將重組質粒轉入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。將包含重組質粒的農桿菌轉化到洋蔥表皮細胞中進行瞬時表達，以包含pBIN m-gfp5-ER空載體的農桿菌EHA105菌液為陽性對照。24 h后用核定位標記碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料對洋蔥表皮細胞進行染色，隨后在激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon, Japan)下觀察LrWRKY4的亞細胞定位。

1.2.3 植物過表達載體的構建及煙草的遺傳轉化以限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ為識別位點，設計基因特異性引物(表1)，以pGEM-T-LrWRKY4為模板通過PCR獲得LrWRKY4 ORF。將目的片段連接到pCAMBIA2300s載體中，轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過PCR篩選出含pCAMBIA2300s-LrWRKY4重組質粒的陽性克隆。將重組質粒轉入根癌農桿菌LBA4404菌株中，經PCR篩選出陽性克隆后轉化野生型(WT)煙草葉盤。煙草遺傳轉化參照張應鵬等[16]的實驗方法。使用CTAB法提取轉基因煙草基因組DNA，采用LrWRKY4的特異性引物進行PCR，篩選陽性轉基因煙草植株。隨機挑選陽性轉基因株系在溫室內自交培育T2代轉基因株系。

1.2.4 轉基因煙草中LrWRKY4的表達及對尖孢鐮刀菌的抗性通過qRT-PCR分析LrWRKY4在隨機選擇的T2代轉基因煙草株系中的表達水平。總RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR反應體系、擴增條件參照Liu等[17]的實驗方法，每個qRT-PCR實驗包含3個生物學重復。以煙草肌動蛋白基因NtACT(AB158612.1)為內參基因，用2-ΔΔCt法分析相關基因的相對表達值。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

表1 實驗所用引物

為了進一步驗證LrWRKY4的功能，選取基因表達水平較高的T2代轉基因煙草株系進行抗病性分析。選擇生長狀態(tài)相同、大小均一的WT和T2代轉基因煙草幼苗葉片，用無菌砂紙在葉片相同位置進行傷害處理，然后在傷口處接種200 μL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)。將感染的葉片平鋪在濾紙上，放在28 ℃氣候箱中培養(yǎng)7 d。此外，還在T2代轉基因煙草株系和WT煙草的根部接種尖孢鐮刀菌。用剪刀將煙草根部剪出傷口，然后浸入尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)中30 min，水培7 d后收集煙草，記錄發(fā)病情況，并使用Photoshop軟件計算葉片病斑面積。每個單株包含3個生物學重復。

1.2.5 轉基因煙草中防衛(wèi)相關基因的轉錄水平挑選LrWRKY4基因表達水平較高的T2代轉基因煙草株系，通過qRT-PCR分析一些防衛(wèi)相關基因在轉基因煙草株系中的轉錄水平。包括JA生物合成途徑相關基因NtLOX(脂氧合酶)、NtAOC(丙二烯氧化物環(huán)化酶)、NtOPR(12-氧代植二烯酸還原酶)、NtJMT(茉莉酸羧基轉甲基酶)、NtAOS(丙二烯氧化物合成酶)、NtPACX(酯?；?Co氧化酶)，病程蛋白相關基因NtGlu2(β-1,3-葡聚糖酶2)、SA信號途徑標記基因NtPR1(病程相關蛋白1)，超氧化物歧化酶NtSOD、NtCu-ZnSOD和NtMnSOD，以煙草肌動蛋白基因為內參基因。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

1.2.6LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鱗片中瞬時表達及對尖孢鐮刀菌的抗性設計帶有attB接頭的特異性引物(表1)擴增LrWRKY4的RNAi片段(463 bp)。使用Gateway?BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix kit (Invitrogen, USA)將PCR產物與pHellsgate2載體進行BP重組反應，然后轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞。再將pHellsgate2-LrWRKY4重組質粒進一步轉化至根癌農桿菌EHA105菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。

用無菌砂紙對健康的岷江百合鱗片進行傷害處理，放在潮濕的濾紙上保濕。將含有重組質粒pHellsgate2-LrWRKY4和空載體pHellsgate2(對照)的農桿菌懸浮液(50 μL)分別滴加到岷江百合鱗片傷口處，然后將鱗片置于28 ℃氣候箱中培養(yǎng)24 h，使載體在岷江百合鱗片中瞬時表達，提取此時百合鱗片總RNA，并通過qRT-PCR檢測瞬時表達RNAi片段后百合鱗片中LrWRKY4的表達水平及JA信號途徑相關基因LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2(植物防御素)，SA信號途徑相關基因LrICS(異分支酸合酶)、LrPAL(苯丙氨酸解氨酶)的表達情況。然后在傷口處接種200 μL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)，置于28 ℃氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集百合鱗片，拍照記錄發(fā)病癥狀，使用Photoshop軟件計算鱗片病斑面積。最后提取百合鱗片總RNA，逆轉錄合成cDNA并進行qRT-PCR實驗，以岷江百合三磷酸甘油醛脫氫酶LrGAPDH(JZ391059)為內參基因。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

1.2.7 統(tǒng)計分析基因表達水平和病斑面積均采用均值和標準差表示。使用SPSS統(tǒng)計分析軟件對所得數(shù)據進行分析和處理，野生型和轉基因植株之間的統(tǒng)計差異采用t檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 LrWRKY4的生物信息學分析

從岷江百合中分離到一個WRKY轉錄因子基因LrWRKY4(MW125549)，全長cDNA為1 138 bp，開放閱讀框為993 bp，5′非翻譯區(qū)為68 bp，3′非翻譯區(qū)為77 bp。生物信息學分析表明，LrWRKY4編碼含330個氨基酸殘基的蛋白質，預測分子量大小為36.8 kD，理論等電點約為6.32。序列分析顯示LrWRKY4蛋白含有一個高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一個C2H2鋅指基序，說明LrWRKY4屬于WRKY轉錄因子家族的Ⅱc組(圖1，A)。LrWRKY4的氨基酸序列與一些單子葉植物WRKY蛋白序列高度相似(圖1，B)。

A. LrWRKY4蛋白結構分析；B. LrWRKY4的氨基酸序列與4條同源序列進行多重比對：Ll. 麝香百合(QIL87957.1)；Eg. 油棕櫚(XP_010924354.1)；Ca. 椰子(KAG1367963.1)；Dc. 鐵皮石斛WRKY71(XP_020688893.1)圖1 LrWRKY4蛋白二級結構預測及序列比對A. The protein structure analysis of LrWRKY4; B. The multiple alignment of LrWRKY4 and four homologous sequences: Ll. L. longiflorum (QIL87957.1); Eg. Elaeis guineensis (XP_010924354.1); Ca. Cocos nucifera (KAG1367963.1); Dc. Dendrobium catenatum (XP_020688893.1)Fig.1 Secondary structure prediction and sequence alignment analysis of LrWRKY4 protein

為了確定LrWRKY4的亞細胞定位，構建了GFP-LrWRKY4融合載體，并通過根癌農桿菌介導的方法將其轉化到洋蔥表皮細胞中進行瞬時表達。如圖2所示，在激光共聚焦顯微鏡下，GFP-LrWRKY4融合蛋白表達的綠色熒光特異性地分布在洋蔥表皮細胞的細胞核中，且與核定位標記PI共定位。而作為對照的GFP蛋白在整個細胞中都能觀察到綠色熒光信號。這表明LrWRKY4是一個細胞核定位蛋白。

圖2 GFP-LrWRKY4融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的瞬時表達Fig.2 Transient expression of GFP-LRWRKY4 protein in onion epidermal cells

2.3 LrWRKY4在煙草中的表達及對尖孢鐮刀菌的抗性

為了進一步分析LrWRKY4的生物學功能，構建了植物過表達載體pCAMBIA2300s-LrWRKY4，將其轉化至模式植物煙草中。以煙草基因組DNA為模板進行PCR，共篩選出45株T0代陽性轉基因煙草(圖3)。將轉基因煙草植株培養(yǎng)于溫室中，通過連續(xù)自交，得到T2代煙草種子，并培養(yǎng)無菌苗。再生的LrWRKY4轉基因煙草與野生型煙草在表型上無明顯差異。通過qRT-PCR分析LrWRKY4在WT和11株T2代轉基因株系(L4-1/3/5/6/18/19/28/32/33/34/37)幼葉中的表達水平。結果表明，LrWRKY4在11個轉基因煙草株系中均有表達(圖4)。其中在L4-37株系中的表達水平最高，在L4-3和L4-28株系中的相對表達水平較低。表明LrWRKY4能夠在轉基因煙草中穩(wěn)定表達。

M. DL2000；1-15. 轉基因煙草；+. pGEM-T-LrWRKY4；-. 野生型煙草圖3 轉LrWRKY4基因煙草的PCR檢測M. DL2000; 1-15. Transgenic tobacco; +. pGEM-T-LrWRKY4; -. Wild-type tobaccoFig.3 PCR detection of LrWRKY4 transgenic tobacco

WT. 野生型煙草；采用t檢驗進行統(tǒng)計學差異分析，** 表示與WT相比在0.01水平差異顯著，圖5、6同圖4 T2代轉基因煙草株系中的LrWRKY4表達WT. Wild-type tobacco; The t test was used to analyze the statistical difference; ** means the significance difference compared with WT at 0.01 level, the same as Fig.5 and Fig.6Fig.4 The expression of LrWRKY4 in T2 generation transgenic tobacco lines

為了評估LrWRKY4轉基因煙草的抗性水平，將煙草根部接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液后水培7 d。結果顯示，WT煙草根部明顯變黑甚至腐爛，葉片開始萎縮，而T2代LrWRKY4轉基因煙草株系的根部健康，未出現(xiàn)發(fā)黑，葉片仍然保持舒展狀態(tài)(圖5，A)。此外，葉片接種實驗也表現(xiàn)出相同的結果。煙草葉片接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液7 d后，轉基因煙草葉片只在接種的傷口附近出現(xiàn)了輕微黃化，伴隨著小面積的腐爛，而WT煙草葉片病斑沿著傷口擴大且出現(xiàn)大面積腐爛黃化(圖5，B)。WT葉片的病斑面積達325 mm2，轉基因煙草株系的病斑面積均低于50 mm2(圖5，C)。這些結果表明LrWRKY4基因在煙草中的過表達提高了煙草對尖孢鐮刀菌的抗性。

A. 根部接種尖孢鐮刀菌；B. 葉片接種尖孢鐮刀菌；C.接種尖孢鐮刀菌后葉片的病變面積圖5 T2代轉LrWRKY4基因煙草的抗性分析A. The roots were inoculated with F. oxysporum; B. The leaves were inoculated with F. oxysporum; C. Lesion area of leaves after F. oxysporum inoculationFig.5 Resistance analysis of T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.4 LrWRKY4轉基因煙草中相關防衛(wèi)基因的轉錄水平

選擇4個LrWRKY4表達量較高的轉基因煙草株系(L4-19/33/34/37)進行進一步的檢測分析，通過qRT-PCR分析JA生物合成途徑相關基因、病程蛋白相關基因SA信號途徑標記基因及抗氧化相關基因在轉基因煙草株系和WT煙草中的表達水平。結果如圖6所示，與WT煙草植株相比，參與JA生物合成途徑相關基因NtLOX、NtAOC、NtOPR、NtJMT、NtAOS、NtPACX的表達量在LrWRKY4轉基因煙草中均有明顯上調。其中NtJMT在L4-33轉基因株系中與WT相比上調了11.7倍，NtAOC在L4-19轉基因株系中與WT相比上調了10.8倍。病程蛋白相關基因NtGlu2、SA信號途徑標記基因NtPR1在LrWRKY4轉基因煙草株系中相對表達量也均有上調，NtGlu2、NtPR1在L4-33轉基因株系中的表達水平分別達到了WT煙草的22和12.5倍。逆境響應相關的3種超氧化物歧化酶基因NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD在轉基因煙草中的相對表達量也有不同程度上調?？傊?，LrWRKY4基因在煙草中的過表達，引起了煙草中JA/SA信號途徑相關基因的表達上調，還誘導了部分病程蛋白相關基因以及抗氧化相關基因的表達，以增強煙草對尖孢鐮刀菌的抗性。

圖6 T2代轉LrWRKY4基因煙草株系中11個防衛(wèi)相關基因的表達水平Fig.6 The expression levels of 11 defense-related genes in T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.5 LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鱗片中的瞬時表達

在岷江百合鱗片中瞬時表達LrWRKY4 RNAi載體，從而分析LrWRKY4表達下調對尖孢鐮刀菌抗性。通過農桿菌介導LrWRKY4 RNAi載體在百合鱗片中瞬時表達，然后接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液。接種72 h后，RNAi載體浸染后和RNAi空載浸染后的岷江百合鱗片均有明顯的腐爛現(xiàn)象(圖7，A)。通過對病斑面積進行測量和計算，發(fā)現(xiàn)LrWRKY4 RNAi載體浸染后的岷江百合鱗片的腐爛程度遠遠大于RNAi空載浸染后的鱗片，前者的平均病變面積約為100 mm2，后者的病變面積不到20 mm2(圖7，B)。同時，qRT-PCR結果顯示，瞬時表達LrWRKY4 RNAi載體的鱗片與對照相比，LrWRKY4的表達水平降低了約45.7%，表明RNAi能夠降低LrWRKY4在百合鱗片中的表達量；此外，瞬時表達LrWRKY4 RNAi載體的鱗片在接種尖孢鐮刀菌72 h后，LrWRKY4的表達水平與對照相比下降了約93.8%(圖7，C)?？梢娫卺航俸削[片中LrWRKY4表達量的降低增加了岷江百合對尖孢鐮刀菌的敏感性。

A. 接種尖孢鐮刀菌72 h后RNAi載體和空載的岷江百合鱗片；B.尖孢鐮刀菌感染后岷江百合鱗片的病變面積(** P < 0.01)；C. RNAi載體及空載中LrWRKY4表達水平(* P < 0.05，** P < 0.01，圖8同)圖7 LrWRKY4 RNAi在岷江百合鱗片中的瞬時表達分析A. The RNAi vector and empty RNAi vector scales of L. regale inoculation F. oxysporum after 72 h; B. The L. regale scale lesions area caused by F. oxysporum infection (** P < 0.01); C. Expression levels of LrWRKY4 in RNAi vector and empty RNAi vector (* P < 0.05, ** P < 0.01, the same as Fig.8)Fig.7 Analysis of the LrWRKY4 RNAi transiently expressed in L. regale scales

2.6 LrWRKY4 RNAi瞬時表達的岷江百合鱗片中JA/SA信號途徑相關基因的表達

為了分析LrWRKY4表達下調對JA/SA信號途徑的影響，檢測了LrWRKY4 RNAi瞬時表達的岷江百合鱗片中JA/SA信號途徑相關基因的表達水平。結果表明，LrWRKY4 RNAi瞬時表達后24 h SA信號途徑相關基因LrICS、LrPAL的表達量與對照相比分別下降了11.8%和8.2%；接種尖孢鐮刀菌72 h后， 2個基因的表達量與對照相比分別降低了47.9%和43.4%(圖8)。此外，JA信號途徑相關基因的表達水平與對照相比顯著下調，LrAOS、LrOPR和LrPDF1.2的表達量分別下降了38.3%、76.9%和36.5%；接種尖孢鐮刀菌72 h后，3個基因的表達水平分別降低了73.9%、92.5%和82.3%。這些結果表明LrWRKY4表達量的降低下調了幾個JA/SA信號途徑相關基因的表達水平。

圖8 瞬時表達LrWRKY4 RNAi的岷江百合鱗片中JA/SA信號途徑相關基因的表達Fig.8 Expression levels of JA/SA signaling pathway related genes in the L. regale scales with LrWRKY4 RNAi transient

3 討 論

WRKY轉錄因子家族是一大類植物轉錄調控因子，參與多種生物學過程，包括生物和非生物脅迫反應、激素反應、生長發(fā)育和次生代謝[18-20]。岷江百合是中國重要的百合抗病種質資源，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)一些岷江百合WRKY轉錄因子響應尖孢鐮刀菌的誘導[15]。從中分離得到了LrWRKY4轉錄因子，結構分析表明LrWRKY4蛋白含有一個高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一個C2H2鋅指基序，說明LrWRKY4屬于WRKY轉錄因子家族的Ⅱc組。已有研究證實，許多Ⅱc類WRKY轉錄因子正調控植物對生物和非生物脅迫的防衛(wèi)反應[21-23]。亞細胞定位結果表明LrWRKY4表達于細胞核中，可能作為轉錄因子調節(jié)靶基因的轉錄。在前人的研究中，一些WRKY轉錄因子也顯示了類似的定位模式[24]。如香蕉(Musaacuminata)的MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60、MaWRKY71，番茄(Solanumlycopersicum) SlWRKY6均定位于細胞核[25-26]。

通過轉基因技術進行轉錄因子基因的異位表達，進而分析轉基因植株中基因轉錄水平的變化，從而可以分析轉錄因子的功能以及調控網絡。SpWRKY3在番茄中的過表達正調控番茄對致病疫霉(P.infestans)的防御反應，表現(xiàn)為壞死細胞數(shù)量減少、病斑面積變小和病害指數(shù)降低，而SpWRKY3沉默后，番茄對致病疫霉抗性減弱[27]。OsWRKY80在水稻(Oryzasativa)中的過表達顯著增強了對紋枯病(Rhizoctoniasolani)的抗性，并上調了轉基因株系中病程相關蛋白基因PR1a、PR1b、PR5和PR10的轉錄水平。而OsWRKY80 RNAi的表達則顯著降低了水稻對紋枯病的抗性，上述病程相關蛋白基因在OsWRKY80 RNAi株系中的表達水平均下降[28]。在本研究中，利用反向遺傳學技術驗證了LrWRKY4的功能。LrWRKY4轉基因煙草表現(xiàn)出了對尖孢鐮刀菌較強的抗性。瞬時表達LrWRKY4 RNAi載體的岷江百合鱗片與對照相比表現(xiàn)出更大的腐爛程度和發(fā)病面積，表明LrWRKY4在岷江百合鱗片中的表達下降增加了對尖孢鐮刀菌的敏感性。上述結果表明，LrWRKY4是岷江百合防御枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的正調節(jié)因子。

在菊花(Chrysanthemummorifolium)中，外源性SA能強烈誘導CmWRKY15-1的表達，在易感菊花中過量表達CmWRKY15-1增強了轉基因植株對柄銹菌(Pucciniahoriana)的耐受性，并且提高了內源SA含量和SA生物合成基因的表達。而在相同條件下，CmWRKY15-1 RNAi植株表現(xiàn)出相反的結果，其對柄銹菌的敏感性增加，內源SA含量降低，表明CmWRKY15-1通過SA信號途徑在菊花對柄銹菌的抗性中發(fā)揮正調控作用[29]。煙草NtWRKY50是一個受多種脅迫因子誘導的基因，馬鈴薯Y病毒(potato virus Y)、紋枯病(R.solani)及黑脛病菌(P.parasitica)侵染、非生物脅迫(熱脅迫、冷脅迫及傷脅迫)和信號分子處理(SA、JA、H2O2及ETH)均能誘導NtWRKY50的表達。NtWRKY50在煙草中過表達導致SA和JA含量上升以及防御相關基因(PR3、H1N1、PR1B、PR2、ACS1和EFE26)的表達量上升[22]。我們的前期研究也表明，SA、MeJA、ETH和H2O2的處理誘導了LrWRKY4的表達量[15]。本研究獲得了過表達LrWRKY4的轉基因煙草株系，分析發(fā)現(xiàn)JA/SA信號途徑相關基因(NtLOX、NtAOC、NtAOS、NtJMT、NtOPR、NtPACX、NtPR1)的表達與WT煙草相比顯著上調。而在RNAi 的百合鱗片中則表現(xiàn)出相反的結果，JA/SA信號途徑相關基因(LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2、LrICS、LrPAL)的表達均下降。此外，幾個病程相關蛋白基因(NtGlu2)、抗氧化脅迫相關基因(NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD)的轉錄水平在轉基因煙草中均有不同程度的上升。可見，LrWRKY4可能參與JA/SA信號途徑調節(jié)岷江百合對枯萎病菌的抗性。

綜上所述，LrWRKY4編碼一個定位于細胞核的Ⅱc類WRKY轉錄因子。過表達LrWRKY4的轉基因煙草對尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出較強的抗性，并且上調了煙草中一系列JA/SA信號途徑相關基因、病程相關蛋白基因以及抗氧化脅迫相關基因的表達水平，從而增強了煙草對尖孢鐮刀菌的抗性。此外，LrWRKY4 RNAi片段的瞬時表達降低了JA/SA信號途徑相關基因的表達并增強了岷江百合對尖孢鐮刀菌的敏感性。這些結果表明，LrWRKY4在岷江百合的免疫應答中起到正調控作用，可能通過參與JA/SA介導的信號傳導途徑，誘導防衛(wèi)相關基因的表達從而調節(jié)岷江百合對尖孢鐮刀菌的抗性。本研究的開展有助于揭示珍稀抗病種質資源岷江百合響應尖孢鐮刀菌侵染的抗性分子機理。