艾灸胃經(jīng)穴調(diào)控EGFR 信號通路對胃癌細胞生長的抑制作用及其機制研究*

聶瑞華 龔 安

（江西中醫(yī)藥大學岐黃國醫(yī)書院，江西 南昌 330025）

胃癌是我國發(fā)病率、致死率較高的惡性腫瘤之一，由于胃癌病因尚未完全清楚，實施針對病因的一級預防非常困難，因此有效防治胃癌前病變，阻斷其向胃癌發(fā)展，已經(jīng)成為預防胃癌、減少其發(fā)病率的重要途徑[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學對胃癌的防治效果尚不理想，但中醫(yī)藥防治胃癌具有療效較好、不良反應少等特點，中醫(yī)藥對慢性萎縮性胃炎癌前病變具有較好的臨床療效。并且經(jīng)臨床研究證實，艾灸對胃癌等惡性腫瘤性疾病有很好的防治作用[2]。惡性腫瘤作為機體在多種復雜不良因素作用下，引起細胞信號傳導紊亂導致相關基因表達失調(diào)而發(fā)生的分子疾病，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，其信號傳導系統(tǒng)的缺陷和異常活化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的關系已成為腫瘤分子生物學的研究熱點，同時通過干預信號傳導途徑治療腫瘤也成為生物治療的新興領域[3，4]。EGFR 信號通路是關鍵的細胞增殖和凋亡相關信號通道之一，該通路的調(diào)控紊亂與胃癌等許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，因此干預該信號通路已成為腫瘤靶向治療的熱點[5]。對此本研究選取純系合格SD 大鼠100 只進行研究，通過探討艾灸胃經(jīng)穴抑制胃癌細胞生長的信號轉(zhuǎn)導機制，揭示艾灸胃經(jīng)穴抑制胃癌細胞生長的調(diào)節(jié)位點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組研究選取純系合格SD 大鼠100 只，雄性，SPF 級，4 周齡，大鼠群養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，每籠5 只，控制室溫22 ℃，相對濕度50%，采用自然光暗周期，自由飲水，檢疫3 周后分組實驗。按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，即正常組、艾灸胃經(jīng)穴組、艾灸對照點組、艾灸胃經(jīng)穴+PD153053組和艾灸對照點+PD153053組，每組20 只。正常飼養(yǎng)1 周后，艾灸胃經(jīng)穴組、艾灸對照點組第2 日起即給予相應處理，至第20 周結束；模型組造模后不予任何治療；正常組不作任何處理，采用同等條件飼養(yǎng)，第20 周后處死所有大鼠。

1.2 實驗儀器與試劑CW0889 哺乳動物細胞抽提試劑盒.康為世紀CW2333SRIPA Lysis Buffer（Str ong）（康為世 紀），CW0049ECL 高靈敏度化 學發(fā)光檢測試劑盒康為世紀，CW0048ECL 低背景學發(fā)光檢測試劑盒（康為世紀），CW02029 一步法快速WB（HRP）試劑盒（兔）（康為世紀），CW02030 一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）康為世紀，CW0056 蛋白印跡膜再生液（康為世紀），ZS-2 板式酶標儀天津泰斯特202-2AB 電熱恒溫箱湘儀（貝克），TGL-20M 臺式高速冷凍離心機（EREE），Jan-78 磁力攪拌器（江蘇其林貝爾），XW-80A 渦旋混合器（浙江鞏義），800臺式低速離心機（貴陽學通），PHS-802 中文臺式酸度計圖像分析軟件（光密度值讀?。篏el-Pro analyzer 4。

1.3 實驗方法

1.3.1 選穴與取穴選取大鼠足陽明胃經(jīng)梁門、足三里穴為治療穴位，對照點為梁門、足三里穴外1 cm，其中足三里位于膝關節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm 處；梁門位于腹正中線與乳頭線之間的中點，臍上4 寸。研究開始時將左右腓骨小頭前下方和劍突下方兩側(cè)的體毛除去，確定穴位后用苦味酸作標記，備用。

1.3.2 艾灸方法將大鼠捆縛于鼠板，正常組、胃經(jīng)對照組和藥物對照組大鼠每天捆綁30 min；艾灸胃經(jīng)穴組和艾灸對照點組大鼠，定位剪毛，將艾條固定于自制艾灸支架上，使艾灸穴位孔（直徑2～3 mm）垂直距離大鼠胃經(jīng)梁門、足三里穴位或非穴對照點0.5 cm，點燃施灸，每日1 次，每次30 min，持續(xù)1周，每次取單側(cè)，兩側(cè)交替使用。

1.3.3 標本采集所有動物實驗結束后，稱取大鼠體質(zhì)量，禁食不禁水24h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剖腹、切開胃，取1/3腺胃部鈍性分離胃黏膜組織，給予標號。（1）艾灸血清的制備：于末次艾灸后1～2h內(nèi)于大鼠腹主動脈取血，低溫4℃離心（3000r/min，5min），取上層血清，分裝，保存于-80℃冰箱，作用于細胞培養(yǎng)體系前置于56℃水浴中30min滅活。（2）腫瘤細胞培養(yǎng)及孵育：①將人胃腺癌細胞株SGC7901培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含青霉素100U/mL，含鏈霉素100U/mL）中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈貼壁生長，形態(tài)良好無退化，待其鋪滿瓶壁70%～80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3d傳代1次，隔日換液。取對數(shù)生長期細胞，棄原培養(yǎng)液，加PBS液沖洗2次，再用0.25%胰蛋白酶消化，機械吹打制成單細胞懸液，以1000r/min離心5min，棄上清液，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整適宜的細胞濃度。②取對數(shù)期生長的胃癌細胞株，用0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)，以每孔100μL接種于96孔板中，使待測細胞密度1×104個細胞/孔，5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（約24h）后，EGFR阻斷組加入10μmol/LPD153035在37℃下共同孵育30min，然后加入5%、10%、20%濃度梯度的艾灸血清培養(yǎng)液（艾灸組）或1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL濃度梯度的艾灸對照點組，每孔100μL，每濃度設5個復孔，5%CO2，37℃繼續(xù)孵育48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)放入CO2培養(yǎng)箱4h。終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，然后進行相關指標檢測。

1.4 觀察指標觀察大鼠胃癌細胞EGFR 基因的表達，并利用Western blot 法檢測胃癌細胞經(jīng)EGFR 阻斷前后p ERK 的表達，采用RT-PCR 法檢測胃癌細胞經(jīng)EGFR 阻斷前后c-myc 基因的表達[6]。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料用（）表示，t 檢驗，多組間比較行方差分析，多組間兩兩比較用SNK-q 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胃癌細胞EGFR基因的表達 5組大鼠癌細胞EGFR 基因表達差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠胃癌細胞EGFR 基因的表達 （）

表1 大鼠胃癌細胞EGFR 基因的表達 （）

2.2 大鼠胃癌細胞EGFR阻斷前后p ERK 的Western blot 檢測結果 5組大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后p ERK 的Western blot 檢測結果對比差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后p ERK 的Western blot 檢測結果 （）

表2 大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后p ERK 的Western blot 檢測結果 （）

2.3 大鼠胃癌細胞EGFR阻斷前后c-myc 基因的表達 5組大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后c-myc 基因的表達差異對比存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后c-myc 基因的表達（）

表3 大鼠胃癌細胞EGFR 阻斷前后c-myc 基因的表達（）

3 討論

經(jīng)研究表明[7]，胃癌的形成并不只是由正常細胞向癌細胞演變的過程，它同時還是一個涉及多基因、多步驟的漸進過程，其中物理化學因素、感染因素、遺傳因素等均可誘發(fā)該疾病，而且物理化學因素是慢性萎縮性胃炎癌前病變的主要原因。目前，臨床對于該疾病的治療以抑制或中和胃酸的藥物、根除幽門螺桿菌的藥物和保護胃黏膜的藥物為主，必要時可長期補充抗氧化維生素、葉酸和β 胡蘿卜素來預防或阻斷胃癌癌前病變的發(fā)生[8]。在中醫(yī)的認知中，胃癌癌前病變多將其劃分至“胃脘痛”和“噯氣”等范疇。早在《靈樞·經(jīng)脈》就已有相關記載“足陽明之脈，是動則病，食則嘔，胃脘痛”，故而普遍認為該疾病的發(fā)病基礎與脾胃虛弱密切相關，而其主要病機為本虛標實、虛實夾雜[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，對于胃癌等惡性腫瘤采用中醫(yī)艾灸療法具有顯著的防治效果，其中足陽明經(jīng)是治療胃腑病癥的首選經(jīng)脈，足三里既是胃經(jīng)的合穴，又是胃的下合穴，對該穴位進行艾灸治療可以有效地發(fā)揮調(diào)節(jié)脾胃，助理運化的作用。但其具體的作用機制如何，尚缺乏相關的研究。

在本研究中以100 只4 周齡清潔級SD 大鼠為實驗對象，分為正常組、艾灸胃經(jīng)穴組、艾灸對照點組、艾灸胃經(jīng)穴+PD153053組和艾灸對照點+PD153053組，實驗20 周后處死制備血清檢測相關指標，以EGFR 信號通路為切入點進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，5組在EGFR 基因表達、p ERK 的Western blot 檢測結果 和c-myc 基因表達方面差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。究其原因可以發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤是機體在多種復雜不良因素作用下，引起細胞信號傳導紊亂導致相關基因表達失調(diào)而發(fā)生的分子疾病，而EGFR 信號通路則是造成細胞增殖和凋亡相關信號通道之一，與疾病的發(fā)生和發(fā)展之間具有重要意義[10]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[11]，EGFR 是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，其配體包括EGF、轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）、肝素結合EGF 樣生長因子等，通過介導多種途徑的信號通路調(diào)控細胞的生長、分化、增殖、遷移和存活等。EGFR 普遍表達于上皮細胞，它的過度表達或突變常與胃癌等許多惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。EGFR信號通路在正常組織中多呈關閉狀態(tài)，而在腫瘤組織中被激活開放，其下游信號轉(zhuǎn)導通路主要包括Ras/Raf/MEK/ERK 途徑，JAK/STAT 途徑和PI3K/Akt途徑，其中Ras/Raf/MEK/ERK 途徑與腫瘤增殖的關系最為密切。EGFR 激活后可相繼活化Ras、Raf、MEK，然后特異性的激活其下游蛋白激酶ERKl/2，最后轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos，N-κB 等，啟動相關基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞增殖、凋亡等過程[12，13]。除此以外，還有研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 的信號傳導通路并不是獨立存在的，各個通路之間存在交叉，使細胞的最終效應受到多種因素的綜合調(diào)控[14]。另外，給予外源性EGF 或刺激內(nèi)源性EGF 分泌的藥物對實驗動物的胃癌前病變有明顯的病理逆轉(zhuǎn)作用，且不增加癌基因如Cerb-B2 的表達。臨床上促進EGF 內(nèi)、外源性分泌的胃黏膜保護劑對胃癌前病變有逆轉(zhuǎn)治療作用[15]。

綜上所述，艾灸胃經(jīng)穴可以干預EGFR 信號通路對癌細胞的介導增長作用，并在PD153035 阻斷后有效抑制癌細胞的增殖和遷移，從而控制病情的發(fā)展，發(fā)揮顯著的治療效果。