1例德朗熱綜合征患兒的NIPBL基因突變分析

徐瑞，張英懿，劉心潔

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，濟(jì)南250012；2壽光市人民醫(yī)院兒科

德朗熱綜合征(CdLS)是一種以嚴(yán)重神經(jīng)發(fā)育障礙為主要表現(xiàn)的遺傳綜合征，其在活產(chǎn)患兒中的發(fā)病率為1/10 000～1/30 000，主要為散發(fā)性，極少為家族聚集性發(fā)生。CdLS的臨床表現(xiàn)包括智力發(fā)育落后、特殊面容、宮內(nèi)和生后生長(zhǎng)遲緩及多臟器畸形等[1-3]。此外，有報(bào)道顯示，CdLS患兒體液免疫受到影響，較普通兒童更易罹患感染性疾病[4]。目前臨床上CdLS經(jīng)典的致病基因有5種：NIPBL、SMC1A、SMC3、RAD21和HDAC8[5]，隨著基因檢測(cè)的普及及檢測(cè)水平的提高，有更多的致病基因被發(fā)現(xiàn)。2020年8月，我們臨床確診1例CdLS患兒，為明確病因，應(yīng)用高通量捕獲測(cè)序進(jìn)行致病基因變異檢測(cè)，并用Sanger測(cè)序驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果以及致病基因的家系分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例介紹 患兒女，2個(gè)月又23 d，因“發(fā)現(xiàn)頭圍偏小1 d”就診于我院門診?；純合档?胎第1產(chǎn)，孕38+6周經(jīng)陰道分娩，出生過(guò)程順利，出生體質(zhì)量3 400 g，生后無(wú)窒息缺氧病史。出生后聽(tīng)性腦干反應(yīng)未通過(guò)，出生第42天復(fù)查通過(guò)?？勺芬暰嚯x眼前20 cm左右的黑白卡。無(wú)相關(guān)家族史。體格檢查：體質(zhì)量4 150 g，頭圍33.7 cm(<-3 SD)，前囟僅容指尖。多毛，眉毛濃密、長(zhǎng)，后發(fā)際線低，耳廓邊緣及背部毛發(fā)多。長(zhǎng)人中，短鼻，口角下歪，上唇薄，小下頜，高腭弓。胸廓無(wú)畸形，心肺無(wú)異常。軀干有兩處2 cm×1 cm咖啡斑，腳趾細(xì)長(zhǎng)，無(wú)通貫掌。四肢肌力、肌張力可，生理反射正常存在，雙側(cè)巴氏征陰性。其母孕期第16周行唐氏篩查無(wú)異常，孕后期多次彩色超聲示胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，雙頂徑<2 SD，家屬拒絕行羊水穿刺行基因檢查。實(shí)驗(yàn)室檢查：患兒近期血常規(guī)、胸片、肝腎功能+心肌酶+生化、甲狀腺功能、血氨未見(jiàn)異常。血串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法未見(jiàn)異常。染色體微陣列(CNV)掃描分析未見(jiàn)異常(見(jiàn)OSID碼圖1)。

1.2 CdLS的判斷 根據(jù)2020年CdLS國(guó)際共識(shí)提出的臨床特征評(píng)分[6]，分為基本特征(2分/項(xiàng))和提示性特征(1分/項(xiàng))?；咎卣靼ǎ孩龠B眉和(或)濃眉；②短鼻、凹鼻嵴和(或)鼻孔前傾；③長(zhǎng)人中和(或)人中扁平；④薄上唇紅和(或)嘴角下彎；⑤少指(趾)畸形和(或)先天性無(wú)指；⑥先天性膈疝。提示性特征包括：①全面發(fā)育遲緩和(或)智力障礙；②胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(<-2 SD)；③出生后生長(zhǎng)遲緩(<-2 SD)；④小頭畸形[產(chǎn)前和(或)產(chǎn)后]；⑤小手和(或)短足；⑥第5指發(fā)育不全或不發(fā)育；⑦多毛。臨床特征評(píng)分≥11分，且包括至少3個(gè)基本特征者診斷為典型CdLS；臨床特征評(píng)分9～10分，且包括至少2個(gè)基本特征者診斷為非典型CdLS；臨床特征評(píng)分4～8分，且包括至少1個(gè)基本特征者，需結(jié)合分子測(cè)試結(jié)果進(jìn)行診斷；臨床特征評(píng)分<4分者不診斷CdLS。

1.3 患兒及其父母全基因組檢測(cè) 經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書(shū)后，抽取患兒及其父母外周血各2 mL，EDTA抗凝，使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取基因組DNA。應(yīng)用GenCap液相捕獲目標(biāo)基因技術(shù)(北京邁基諾公司)，捕獲與CdLS相關(guān)的包含CdLS相關(guān)基因(NIPBL、SMC3、RAD21、SMC1A和HDAC8)的編碼外顯子區(qū)域和側(cè)翼區(qū)域。利用Illumina Nextseq 500第二代測(cè)序儀捕獲到的區(qū)域進(jìn)行雙端測(cè)序，讀長(zhǎng)為150 bp。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序后，去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。運(yùn)用BWA軟件比對(duì)到參考基因組上(hg19版本)，對(duì)測(cè)序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

使用GATK軟件對(duì)該樣本的比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失突變(InDels)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，查找SNPs及InDels在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)、Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500外顯子測(cè)序計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)、ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)(ALL和EAS)及邁基諾內(nèi)部1 000例正常漢族人群數(shù)據(jù)庫(kù)頻率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP+等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SNPs及InDels的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，篩選上述數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率<0.05且預(yù)測(cè)結(jié)果均為致病性的位點(diǎn)作為與疾病相關(guān)的位點(diǎn)。

根據(jù)需要測(cè)序的DNA片段合成引物，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法進(jìn)行擴(kuò)增，用ABI3730xl測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)以Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 患兒CdLS臨床特征評(píng)分結(jié)果 患兒CdLS臨床特征評(píng)分11分，且包括4個(gè)基本特征，符合典型CdLS的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 患兒及其父母全基因組檢測(cè)結(jié)果 全外顯子基因組測(cè)序檢出患兒NIPBL基因第6外顯子存在c.461G>A雜合錯(cuò)義突變。NIPBL基因c.461G>A變異在各基因數(shù)據(jù)庫(kù)及近期文獻(xiàn)中均無(wú)該位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道，該位點(diǎn)變異為未報(bào)道過(guò)的新變異。生物信息學(xué)蛋白功能綜合性預(yù)測(cè)軟件REVEL預(yù)測(cè)結(jié)果為潛在有害，SIFT、MutationTaster、GERP+預(yù)測(cè)結(jié)果為有害、有害、有害。

經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，該變異存在于患兒及患兒父親，c.461G>A可導(dǎo)致編碼蛋白第154位精氨酸替代為谷氨酰胺(p.R154Q)，見(jiàn)圖1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，其父該位點(diǎn)為雜合突變，其母該位點(diǎn)無(wú)變異，其父手臂處多毛，無(wú)特殊面容、智力發(fā)育落后、生長(zhǎng)發(fā)育落后、多臟器畸形等表現(xiàn)。

注：A為患兒，箭頭所指位置有A與G兩種核糖核苷酸，存在雜合變異；B為患兒父親，箭頭所指位置有A與G兩種核糖核苷酸，存在雜合變異；C為患兒母親，箭頭所指位置有G一種核糖核苷酸，無(wú)變異。

3 討論

CdLS是一種以嚴(yán)重神經(jīng)發(fā)育障礙為主要表現(xiàn)的遺傳綜合征，多數(shù)為散發(fā)病例，<1%的患者有同樣受累的父母[6]。目前其診斷主要根據(jù)2020年CdLS國(guó)際共識(shí)提出的臨床特征評(píng)分，本例患兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(1分)，具有典型的特殊面容，如小頭畸形(1分)、前發(fā)際線低、濃眉(2分)、長(zhǎng)睫毛、鼻梁凹陷(2分)、寬鼻尖、長(zhǎng)且扁平的人中(2分)、薄上唇紅、嘴角下彎(2分)、多毛癥(1分)，總評(píng)分共11分，且包括4個(gè)基本特征，可確診為典型的CdLS。

患兒因生后查體發(fā)現(xiàn)頭圍偏小就診于我院門診，經(jīng)門診再次詳細(xì)查體評(píng)估后臨床診斷為典型CdLS，為進(jìn)一步驗(yàn)證臨床診斷，故行相關(guān)基因檢測(cè)。全外顯子基因組測(cè)序結(jié)果顯示，該患兒NIPBL基因第6外顯子存在c.461G>A雜合錯(cuò)義突變；其父該位點(diǎn)為雜合突變，其父體征上除手臂出多毛外無(wú)特殊面容、生長(zhǎng)發(fā)育落后表現(xiàn)；其母該位點(diǎn)無(wú)變異，為野生型。為驗(yàn)證該突變位點(diǎn)與患兒病癥的關(guān)系，經(jīng)生物信息學(xué)蛋白功能綜合性預(yù)測(cè)軟件REVEL分析，預(yù)測(cè)結(jié)果為潛在有害，SIFT、MutationTaster、GERP+預(yù)測(cè)結(jié)果均為有害。因此推測(cè)，NIPBL基因c461G>A(p.R154Q)錯(cuò)義變異可能是該患兒的發(fā)病原因，因該變異在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)及近期文獻(xiàn)中未有該位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道，為未報(bào)道過(guò)的新變異，該新變異的檢出豐富了NIPBL基因變異譜。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，該位點(diǎn)突變存在于患兒及患兒父親。該突變位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上NIPBL基因中，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，該患兒發(fā)病;攜帶同一基因的父親有部分陽(yáng)性體征，但臨床特征評(píng)分<4分者不能診斷CdLS，推測(cè)患兒父親為外顯不全。常染色體顯性遺傳的家系中偶見(jiàn)攜帶致病基因突變個(gè)體不患病，表現(xiàn)為不完全外顯，該個(gè)體稱為頓挫型，頓挫型可不表現(xiàn)顯性形狀或部分表現(xiàn)，但可以把顯性基因傳遞下去，使后代具有顯性癥狀。在系譜中，由于頓挫型的存在常染色體顯性遺傳可以出現(xiàn)隔代遺傳。如BOYLE等[7]2017年報(bào)道了1例CdLS患者的母親及姨媽攜帶與患者相同的RAD21基因單堿基對(duì)缺失，但不符合CdLS的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，考慮與RAD21基因相關(guān)的外顯不全有關(guān)。

CdLS是一種罕見(jiàn)的多系統(tǒng)遺傳疾病，目前臨床認(rèn)可的與CdLS發(fā)病相關(guān)變異基因有NIPBL、SMC1A、SMC3、RAD21、HDAC8、BRD4、ANKRD11、AFF4、ARIDIB、EP300、KMT2A、NAA10、SETD5、SMARCB1、TAF6、ZMYND11、PHIP、MED13L、MAU2等[8-11]。不同的基因變異所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)存在一定的差異，其中70%的患兒發(fā)病與NIPBL基因變異有關(guān)，但并不是所有NIPBL基因變異都能導(dǎo)致CdLS。NIPBL編碼的Nipped-B-like(NIPBL)蛋白是Cohesin復(fù)合體的裝載蛋白，鑒定為真菌和蒼蠅姐妹染色單體內(nèi)聚蛋白2(SCC2)的人類同源物，它與SCC2形成復(fù)合體，是黏著蛋白裝載到染色體上所必需的，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12-13]。在其他的發(fā)病相關(guān)變異基因中，如SMC1A、SMC3，已被證實(shí)與黏著蛋白有直接關(guān)系，而如ANKRD11等編碼基因，則不直接相關(guān)。根據(jù)有無(wú)黏著蛋白相關(guān)基因突變，可將患兒分為經(jīng)典型及非經(jīng)典型，部分患兒可同時(shí)有經(jīng)典型及非經(jīng)典型相關(guān)基因突變。本例患兒基因突變位點(diǎn)位于NIPBL基因，考慮為經(jīng)典型。

CdLS患兒除特殊面容、肢體畸形外，還可出現(xiàn)嚴(yán)重的智力障礙，包括交流能力下降、重復(fù)行為和自殘行為以及多動(dòng)，未來(lái)可能發(fā)展為自閉癥。其中交流能力下降主要表現(xiàn)為口語(yǔ)的落后，多通過(guò)手勢(shì)來(lái)表達(dá)[14-15]。因此，早期確診并進(jìn)行干預(yù)對(duì)提高患兒的語(yǔ)言行為能力、保持其心理健康具有重要意義。隨著產(chǎn)前檢查技術(shù)水平的提升，針對(duì)CdLS的產(chǎn)前診斷越來(lái)越多，胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、特殊面容、多系統(tǒng)畸形(如心臟畸形、消化道畸形等)在產(chǎn)前胎兒超聲中均可發(fā)現(xiàn)。對(duì)發(fā)現(xiàn)以上臨床特征的胎兒，以及有CdLS家族史的高危人群，可對(duì)孕婦進(jìn)行羊水穿刺、收集胎兒脫落的細(xì)胞行基因檢測(cè)以明確診斷，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

目前針對(duì)CdLS尚無(wú)有效的治療方法，主要采取對(duì)癥支持治療及康復(fù)訓(xùn)練。根據(jù)系統(tǒng)受累程度不同，針對(duì)患兒的隨訪、管理是不同的，發(fā)育遲緩的患兒應(yīng)及早進(jìn)行康復(fù)治療干預(yù)，多臟器畸形如先天性心臟病等可進(jìn)行針對(duì)性治療及護(hù)理。CdLS患兒應(yīng)根據(jù)病情定期隨訪，隨訪項(xiàng)目根據(jù)患兒年齡、疾病嚴(yán)重程度及累及系統(tǒng)制定。該例患兒在門診康復(fù)治療1個(gè)月后發(fā)育評(píng)估報(bào)告較前好轉(zhuǎn)，但落后于正常同齡兒。研究顯示，CdLS的發(fā)病機(jī)制與多種信號(hào)通路相關(guān)，其中包括經(jīng)典的WNT通路。近期有研究顯示，氯化鋰可通過(guò)活化經(jīng)典WNT通路，對(duì)CdLS模型有改善作用，提出鋰作為CdLS的可能治療策略[16]，為臨床治療提供了一種新的選擇。

綜上所述，CdLS臨床主要表現(xiàn)為智力發(fā)育落后、特殊面容、宮內(nèi)和生后生長(zhǎng)遲緩及多臟器畸形等，可結(jié)合基因結(jié)果進(jìn)一步明確診斷。本例CdLS診斷明確，NIPBL基因c461G>A(p.R154Q)錯(cuò)義變異可能是其發(fā)病原因，該變異為新發(fā)基因突變，豐富了NIPBL基因變異譜。