齊墩果酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

鄭霞薇，黃麗麗，謝國(guó)民

缺血性腦卒中是急性腦血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性壞死所致的臨床綜合征，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率等特點(diǎn)，然而目前臨床上仍缺乏有效的治療藥物[1-4]。齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于各種植物中，如丁香、大蒜葉等，具有抗凋亡、抗氧化及抗腫瘤等作用[5-6]。Rong 等[7]發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，然而其潛在的機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道齊墩果酸可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞凋亡，減輕大鼠肝再灌注損傷[8]。因此，本研究旨在探討齊墩果酸對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作及其調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選取健康清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠45 只，體質(zhì)量250～280 g，飼養(yǎng)于室溫21～25℃，濕度50%的環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)方針。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程

1.2.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD 大鼠分為假手術(shù)組，腦缺血再灌注組，齊墩果酸組，齊墩果酸+DMSO 組，齊墩果酸+LY294002（PI3K 抑制劑）組。

1.2.2 藥物干預(yù) 齊墩果酸組、齊墩果酸+DMSO組、齊墩果酸+LY294002 組大鼠于術(shù)前4 d 開(kāi)始腹腔注射齊墩果酸（25 mg/kg），每天1 次；假手術(shù)組及腦缺血再灌注組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。齊墩果酸+LY294002 組和齊墩果酸+DMSO組大鼠分別于術(shù)前4d側(cè)腦室注射10μl10mmol/L LY294002 溶液（LY294002加入DMSO 中配制而成）或10μl DMSO 溶液1 次。

1.2.3 側(cè)腦室注射 大鼠麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮消毒后頭部正中作1 cm 切口，清楚暴露前囟點(diǎn)，以前囪點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)，向右旁開(kāi)1.4mm，向后1mm為注射點(diǎn)，顱骨鉆頭鉆取顱孔，在腦立體定位儀的引導(dǎo)下將微量注射器針頭垂直插入4.5mm，即達(dá)側(cè)腦室，以2μl/min的注射速度注射10μlLY294002 溶液或10μlDMSO溶液，后緩慢退出注射器，縫合皮膚。

1.2.4 模型制備 參照改良ZeaLonga線栓法制備腦缺血再灌注模型。SD 大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后消毒頸部皮膚，作頸部正中縱行切口，仔細(xì)分離血管和神經(jīng)。線栓從頸外動(dòng)脈插入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈直至大腦中動(dòng)脈起始處，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈的梗阻。2 h 后重新麻醉，拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再通。假手術(shù)組按上述方法分離組織及暴露神經(jīng)和血管，插入線栓，但不阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。

1.2.5 神經(jīng)功能損傷評(píng)分 術(shù)后24 h 采用Rogers神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（具體評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表1）對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。為了控制實(shí)驗(yàn)基線水平，若Rogers 評(píng)分為0、6 或7 分，以及出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)t不納入后續(xù)試驗(yàn)。

表1 Rogers 神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 TUNEL 染色 術(shù)后24 h 對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉，先后予0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)左心室灌流，迅速斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋并切片（厚度5μm）。切片脫蠟后，使用原位細(xì)胞凋亡TUNEL 試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞。正置熒光顯微鏡下觀察（×200 倍數(shù)）腦梗死周圍組織的凋亡情況，Image-ProPlus 圖像分析處理系統(tǒng)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè) 采用Western Blot 檢測(cè)Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt 蛋白水平。術(shù)后24 h 各組大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg/kg）、0.9%氯化鈉注射液左心室灌流后斷頭取腦，冰上分離出腦梗死周圍腦組織，與裂解液按比例混合后，經(jīng)勻漿、裂解、超聲提取組織蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)濃度制備Western Blot 上樣品，分別進(jìn)行SDSPAGE 電泳分離，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，經(jīng)5%脫脂奶封閉、一抗孵育、二抗孵育后，凝膠成像儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描曝光，Imag Lab 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism、Photoshop 進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的影響 假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)神經(jīng)功能缺損的癥狀。其他4 組大鼠術(shù)后24 h 神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.605，P＜0.05），其中齊墩果酸組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），齊墩果酸+LY294002 組神經(jīng)功能缺損評(píng)分高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見(jiàn)彩圖1。

圖1 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的影響

2.2 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響 5 組大鼠術(shù)后24 h時(shí)梗死側(cè)梗死灶周腦組織細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.611，P＜0.05），其中腦缺血再灌注組細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組（P＜0.05），齊墩果酸組細(xì)胞凋亡率低于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO組細(xì)胞凋亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），齊墩果酸+LY294002 組細(xì)胞凋亡率均高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見(jiàn)彩圖2。

圖2 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

2.3 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響 5 組大鼠術(shù)后24 h 梗死側(cè)梗死灶周腦組織Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.612、10.394，均P＜0.05）。其中腦缺血再灌注組Bax 蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組，Bcl-2 蛋白表達(dá)量低于假手術(shù)組（均P＜0.05）；齊墩果酸組Bax 蛋白表達(dá)量低于腦缺血再灌注組，Bcl-2 蛋白表達(dá)量高于腦缺血再灌注組（均P＜0.05）；齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；齊墩果酸+LY294002 組Bax 蛋白表達(dá)量高于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組，Bcl-2 蛋白表達(dá)量低于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見(jiàn)彩圖3。

圖3 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后p-Akt/Akt 的影響 5 組大鼠術(shù)后24 h 梗死側(cè)梗死灶周腦組織p-Akt/Akt 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.216，P＜0.05）。其中腦缺血再灌注組p-Akt/Akt 低于假手術(shù)組（P＜0.05），齊墩果酸組大鼠p-Akt/Akt 高于腦缺血再灌注組（P＜0.05），齊墩果酸組與齊墩果酸+DMSO 組p-Akt/Akt 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；齊墩果酸+LY294002 組p-Akt/Akt 均低于齊墩果酸組和齊墩果酸+DMSO 組（均P＜0.05）。見(jiàn)彩圖4。

圖4 齊墩果酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后p-Akt/Akt 的影響

3 討論

缺血性腦卒中所造成的腦損傷與眾多病理過(guò)程相關(guān)，包括谷氨酸興奮毒性、凋亡、鈣超載及活性氧生成等[9]。近年來(lái)，盡管許多藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，但都未能通過(guò)嚴(yán)格的臨床隨機(jī)試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究主要目的是加深對(duì)腦梗死發(fā)病機(jī)制的了解，并促進(jìn)腦梗死臨床治療藥物的研發(fā)。

近年來(lái)，有文獻(xiàn)指出齊墩果酸是缺血性腦卒中潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物[10]。Rong 等[7]發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能顯著延長(zhǎng)急性腦缺血小鼠生存時(shí)間，改善神經(jīng)功能。Caltana 等[11]研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸在大鼠局灶性腦缺氧模型中也發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，齊墩果酸神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。大量研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸在許多動(dòng)脈模型中發(fā)揮抗凋亡作用，如肝缺血再灌注損傷、急性肺損傷及脊髓損傷等[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能顯著降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，TUNEL染色結(jié)果表明齊墩果酸明顯減少腦缺血再灌注大鼠凋亡細(xì)胞，Western Blot 結(jié)果表明齊墩果酸明顯增加腦缺血再灌注大鼠Bcl-2 的表達(dá)、減少Bax 表達(dá)。由此可見(jiàn)，齊墩果酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與其抗細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。

PI3K/Akt 是一種細(xì)胞生存通路，具有抗凋亡、減輕炎癥的作用[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道齊墩果酸可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制肝再灌注損傷大鼠的肝細(xì)胞凋亡[8]。本研究通過(guò)Western Blot 法檢測(cè)腦缺血再灌注大鼠的p-Akt、Akt 的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明腦缺血再灌注大鼠p-Akt/Akt 顯著下調(diào)，而給予齊墩果酸治療后p-Akt/Akt 顯著上調(diào)。而給予腦缺血再灌注大鼠齊墩果酸和PI3K 抑制劑LY294002 共同處理后，p-Akt/Akt顯著下調(diào)，且齊墩果酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠的抗凋亡作用受到顯著的抑制。由此可見(jiàn)，齊墩果酸是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT 通路減少大鼠腦缺血/再灌注后的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，齊墩果酸是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT 通路減少大鼠腦缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果可為腦梗死的臨床治療提供新的治療藥物，且對(duì)緩解腦梗死患者的臨床癥狀，改善預(yù)后具有重要價(jià)值。