湖羊乳房炎病原菌的分離鑒定及其耐藥性分析

薛瑞林，高 強，李守湖，柳紀省，馬友記,3*

(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省肉羊繁育生物技術工程試驗室，甘肅 民勤 733300)

隨著我國養(yǎng)羊業(yè)逐步向集約化、規(guī)模化方向發(fā)展，養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖規(guī)模轉變，羊群運動量減少，加之飼養(yǎng)管理方面的不足，乳房炎已經成為影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的重要因素。引發(fā)乳房炎的因素有很多，但歸根結底是由病原微生物感染引起。在乳房炎諸多病原中，以細菌型感染最為常見。當細菌感染動物乳房時，泌乳細胞受到破壞，影響泌乳機能，導致產奶量減少，乳品質下降，甚至喪失泌乳機能，繼而影響羔羊發(fā)育和健康，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。目前，臨床上治療和控制羊乳房炎主要依賴抗生素。但是，臨床上抗生素的不合理使用導致細菌產生多重耐藥性，在乳汁中常常伴有大量的藥物殘留，造成企業(yè)養(yǎng)殖成本大大增加，同時威脅著人類的健康。因此，及時準確的掌握養(yǎng)殖場乳房炎病原菌的種類和耐藥性情況是治療乳房炎的關鍵。

中草藥作為一種傳統(tǒng)的“天然藥材”，因其副作用小、無毒無殘留、不易產生耐藥性而成為近年來治療乳房炎的熱門選擇。并且中草藥成分豐富，富含糖類、皂苷類、生物堿、揮發(fā)性物質和有機酸等多種免疫活性成分，不僅對疾病和病原微生物有抑制作用，還能增強動物生產力、免疫力和繁殖能力，具有良好的替抗?jié)摿?。本研究就使用復方中草藥制劑，進行體外抑菌試驗，探究該制劑對于乳房炎病原菌的抑菌效果，為該制劑在臨床上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 觀察綿羊乳房紅腫、發(fā)熱，觸摸有硬塊，以及乳汁有絮狀或凝塊等肉眼可見變化即可判定為患有臨床乳房炎。選取10只患有臨床乳房炎的湖羊，采集20份乳樣，每份10 mL，置滅菌50 mL離心管中加蓋密封，置于附有冰袋的采樣箱內低溫保存，送回試驗室進行病原菌分離及鑒定。

1.1.2 試劑及設備 革蘭氏染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；一次性無菌平皿(90 mm)，牛津杯 (6×8×10 mm)，購自北京博納瑞生科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司；DNA Marker，Ex Taq酶，購自TaKaRa生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自OMEGA公司；藥敏試劑盒、哥倫比亞血平板培養(yǎng)基購于杭州天和微生物試劑有限公司；PCR引物合成及擴增產物測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；復方中草藥制劑由蘭州威特森生物科技有限公司自主研發(fā)和提供；其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化及培養(yǎng) 將采集的乳樣先進行細菌富集，搖勻乳樣，無菌條件下取適量乳樣加到滅菌后的普通營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 rpm條件下，恒溫搖床培養(yǎng)12 h，再將富集后的菌液分別劃線接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血平板上，37 ℃溫箱孵育24 h，觀察菌落的形態(tài)，挑取具有典型特征的菌落進行分離培養(yǎng)，直至獲得單一病原菌。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學和分子生物學鑒定 觀察病原菌菌落形態(tài)，挑取典型純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢，挑選鏡檢涂片無雜菌者，提取菌體DNA，以提取的DNA為模板，使用細菌16S rDNA通用引物進行擴增，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，預期目的片段1 500 bp。將PCR擴增的基因產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物純化后送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對，結合傳統(tǒng)微生物鑒定法判定病原菌。

1.2.3 菌液和復方中草藥制劑的制備 取純化培養(yǎng)后的菌株劃線于普通肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱培養(yǎng)12～16 h后，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃、200 rpm培養(yǎng)12 h，利用平板菌落計數法對三種菌進行計數，調整菌液的終濃度為10CFU/ mL，標記后備用。

復方中草藥制劑主要成分為白頭翁、板藍根、柴胡、丹參、黃芪、當歸。該藥品經離心、過濾和濃縮的預處理，使得生藥含量為1.0 g/mL。根據預試驗結果，將試劑離心后上清液二倍稀釋為500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL和15.625 mg/mL等6個濃度梯度的藥液，121 ℃高壓滅菌，標記后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 耐藥試驗 參照鄧海平的方法采用藥敏紙片法進行抗生素的藥敏試驗，參照陳薇的方法采用牛津杯法進行復方中草藥制劑的藥敏試驗。即吸取0.1 mL制備好的菌懸液，滴入事先準備好的經過高壓滅菌的普通營養(yǎng)瓊脂平板內，使用涂布器涂勻，再分別放置抗生素藥敏紙片和牛津杯，牛津杯中加入0.2 mL制備好的不同濃度中草藥制劑，每株分離菌設3個重復。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察試驗結果，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑，結果取平均值。結果判定標準：抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥(R)、10 mm～15 mm為中度敏感(I)、大于15mm為敏感(S)。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)測定 復方中草藥制劑對3種乳房炎病原菌MIC值的測定參考柯文杰等的方法進行：將稀釋的復方中草藥制劑按濃度大小依次分裝至試管，每個試管2 mL。再往每個濃度梯度試管中分別加入100 μL菌液，每個樣品做3個重復。同時每個梯度組設1支不含復方中草藥制劑只含等量菌液的陽性對照管以及1支不含菌液只含復方中草藥制劑的陰性對照管。37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，肉眼觀察無細菌生長時的最低藥物濃度為該制劑的MIC值。

1.2.6 最小殺菌濃度(MBC)測定 MBC的測定參考聶鱺蓉等的方法進行：從每種細菌的MIC和高于MIC濃度的各試管中分別吸取100 μL培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，肉眼觀察無菌落生長的最低濃度即為該制劑的MBC值。

2 結果與分析

2.1 細菌形態(tài)學鑒定

純化后細菌在血平板上培養(yǎng)形成三種不同形態(tài)的菌落，分別命名為gs1、gs2、gs3。gs1在血平板上生長良好，形成灰白色、不透明、表面光滑、直徑0.5～1 mm大小的圓形菌落。gs2在血平板可見灰白色、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起的圓形菌落。gs3在血平板可見金黃色，凸起，表面光滑的圓形菌落，并可見溶血圈。放在油鏡下觀察，gs1為革蘭氏陽性菌，菌體呈球狀，多單個或成雙排列；gs2顯示為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，兩端呈鈍圓形，短鏈很少出現；gs3為革蘭氏陽性菌，菌體為球狀，并可見葡萄串狀排列(如圖1所示)。

2.2 病原菌分子生物學鑒定

通過對菌組DNA進行PCR擴增，得到3條長度序列約為1 500 bp左右的PCR擴增產物，符合試驗預期(如圖2)。

PCR產物測序及BLAST比對結果顯示結果顯示，在分離得到的病原菌中，14株檢出細菌的16S rDNA序列，分別與GenBank公開的金黃色葡萄球菌菌株NBRC 100910(登錄號為NR113956.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，確定為金黃色葡萄球菌，占總分離菌株數的50%；10株檢出細菌的16S rDNA序列，分別與大腸桿菌株E84-1(登錄號為KJ477001.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，確定為大腸桿菌，占總分離菌株數的36%；另外4株則分別與糞腸球菌株NBRC 100490(登錄號為NR113906.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，占總分離菌株數的14%。

圖1 三種細菌在血平板上的菌落形態(tài)(左)及革蘭氏染色鏡檢結果(右)Fig. 1 Colony morphology of three bacteria on blood plates (left) and Gram staining microscopy results (right)

圖2 分離菌株凝膠電泳結果Fig. 2 Results of gel electrophoresis of isolated strains

2.3 耐藥試驗

2.3.1 抗生素耐藥試驗 抗生素藥敏試驗結果如表2所示。以上結果表明，3種病原菌對諾氟沙星、左氟沙星、氯霉素、慶大霉素及環(huán)丙沙星敏感性較好，對青霉素、紅霉素和氨芐西林有較強的耐藥性。

2.3.2 復方中草藥制劑耐藥試驗 復方中草藥制劑耐藥試驗結果如表3所示。結果顯示，該中草藥制劑能有效抑制3種乳房炎病原菌的生長，并且藥物濃度相同的情況下，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑普遍大于其余兩種細菌。

2.3.3 MIC值和MBC值的測定 復方中草藥制劑對糞腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗結果表明，該制劑對3種乳房炎病原菌的MIC依次分別為125 mg/mL、125 mg/mL和62.5 mg/mL，MBC分別為250 mg/mL、125 mg/mL和125 mg/mL。

表2 抗生素耐藥試驗結果Table 2 Antibiotic resistance test results

表3 復方中草藥制劑耐藥試驗結果Table 3 Resistance test results of compound Chinese herbal medicine preparations

3 討 論

3.1 病原菌分離鑒定

引發(fā)羊乳房炎的病原菌種類繁多，金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、化膿性棒狀桿菌、芽孢桿菌、結核桿菌等都可以引發(fā)羊乳房炎。李強等曾對河南某湖羊養(yǎng)殖場乳房炎病原菌進行分離鑒定，得到葡萄球菌和大腸桿菌兩種病原菌。本次試驗分離結果與其基本一致，但本次試驗還分離得到糞腸球菌。本次試驗分離得到湖羊乳房炎主要病原菌種類與他人研究存在差異的原因可能是地理位置對于乳房炎病原菌分布的影響，亦或是養(yǎng)殖場環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式以及當地氣候的不同造成湖羊對于乳房炎病原菌易感性的變化。

3.2 抗生素耐藥試驗

藥敏試驗結果顯示，本次試驗分離得到3種病原菌對諾氟沙星、左氟沙星、氯霉素、慶大霉素及環(huán)丙沙星敏感性較好，并且金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對于諾氟沙星和左氟沙星的敏感性要強于糞腸球菌。但3種細菌均對青霉素、紅霉素和氨芐西林有較強的耐藥性。張明國等曾對四川攀西地區(qū)奶牛乳房炎病原菌進行分離鑒定和耐藥性分析，得到大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、屎腸球菌等17種乳房炎病原菌，其中大部分病原菌對慶大霉素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等藥物敏感，對青霉素、甲氧芐氨嘧啶和氨芐西林等藥物呈現較強耐藥性。與本研究結果基本一致，所不同的是，本研究所得病原菌對紅霉素耐藥。乳房炎主要致病菌的藥敏結果存在的差異可能是因為不同地區(qū)針對乳房炎的常用防治方法、用藥習慣存在差異致使不同地區(qū)的病原菌的耐藥性產生差異。病原菌耐藥性的產生主要是因為在臨床治療時長期或大量反復使用該類抗生素，導致病原菌對其產生耐藥性。因此，在生產中進行乳房炎防治時，應當盡量避免是長期使用單一抗生素，采用多種藥物合用或輪流使用的方法。進行乳房炎治療時若使用某類或某種藥物發(fā)現病情并沒有改善時應當及時停止該類藥物的使用更換其他藥物，避免病原菌耐藥性的產生，并加強病原菌耐藥情況的監(jiān)控。

3.3 復方中草藥耐藥試驗

本試驗用菌株均從患臨床型乳房炎湖羊乳中分離鑒定得到，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均為常見的乳房炎高致病菌，而糞腸球菌也是常見的乳房炎病原菌，用復方中草藥制劑對這3種病原菌做藥敏測定，其結果對臨床試驗更具有參考意義。許多研究表明，中藥及其提取物可以直接殺滅病原菌或通過多種途徑提高機體免疫力達到防治疾病的效果。本研究就采用相比于醇提法操作更為簡單、成本更為低廉的水提法提取白頭翁、柴胡、黃芪、當歸等6味中草藥的有效成分，進行乳房炎病原菌的體外抑菌試驗。結果顯示，復方中草藥制劑對引起湖羊乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有良好的抑殺作用，對金黃色葡萄球菌抑殺作用最強，本試驗結果與金蘭梅研究結果基本一致。本試驗研究認為,該制劑對湖羊乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有很好的抑殺作用，對臨床上使用中草藥制劑防治湖羊乳房炎，篩選對乳房炎病原菌有良好抑殺作用的中草藥物進行防治湖羊乳房炎的獸藥研發(fā)具有一定的指導意義。

4 結 論

該養(yǎng)殖場臨床乳房炎的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及糞腸球菌，3種菌均對青霉素、紅霉素、氨芐西林有較強耐藥性，對諾氟沙星、左氟沙星、氯霉素、慶大霉素及環(huán)丙沙星敏感性較好。復方中草藥制劑能有效抑殺3種病原菌。