黃連炭疽病病原鑒定及其對(duì)殺菌劑敏感性測(cè)定

莫維弟,方 茜,程歡歡,周志成,丁海霞，2*

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550006)

黃連()為毛茛科多年生草本植物，以根莖入藥，具有瀉火、解毒、清熱、燥濕等功效，是我國(guó)常見中藥材。重慶市石柱縣是黃連的主產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)量約占我國(guó)總產(chǎn)量的60%。隨著黃連產(chǎn)業(yè)化和種植面積的增加，黃連病害的發(fā)生漸趨加重，其中黃連炭疽病發(fā)病率逐年上升。黃連炭疽病主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全葉枯死，植株萎蔫，嚴(yán)重影響黃連的品質(zhì)和產(chǎn)量。本研究對(duì)石柱縣黃連炭疽病病原進(jìn)行分離和致病性測(cè)定，依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)，結(jié)合、、-和基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)比分析，確定病原菌種類，并測(cè)定其對(duì)殺菌劑的敏感性，以期為黃連炭疽病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及癥狀觀察

調(diào)查重慶市石柱縣中藥材基地黃連炭疽病的發(fā)生和危害情況，記錄發(fā)病部位、典型癥狀。剪取黃連植株葉片發(fā)病組織，裝于無(wú)菌塑料自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的分離與鑒定

..病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法，切取黃連病葉病健交界處5 mm×5 mm的小塊，經(jīng)70%乙醇表面消毒1 min和無(wú)菌水洗3次后，接種到PDA平板上進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待組織塊周圍長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化。純化后的菌株做好標(biāo)記后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

..形態(tài)學(xué)鑒定

將分離到的菌株接種于PDA平板上，25 ℃恒溫光照培養(yǎng)7 d后，觀察記錄菌落特征、生長(zhǎng)速度，孢子形態(tài)等。收集無(wú)性孢子并用無(wú)菌水懸浮，將孢子懸浮液滴加至載玻片上，于25 ℃培養(yǎng)24 h后觀察附著孢的產(chǎn)生。

..分子鑒定

采用真菌DNA提取試劑盒(Biomiga Fungal gDNA Kit)提取供試菌株DNA，選擇引物ITS4/ITS5、GDF1/GDR1、CHS-79F/CHS-345R和ACT512 F/ACT783R分別對(duì)、、-1和基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，后將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得到的核苷酸序列在GenBank進(jìn)行Blast同源性比較。將、、-和基因序列上傳至GenBank，其對(duì)應(yīng)登錄號(hào)分別為MN542218、MN542219、MN54 2220和MN542221。本研究根據(jù)Moriwaki和Damm獲得用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株及其登錄號(hào) (表1)，并從GenBank中下載參考序列，采用BioEdit軟件處理4個(gè)保守基因、、-和組合序列數(shù)據(jù)，應(yīng)用自展法(bootstrap)用軟件MEGA 7.0對(duì)菌株HL8構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)據(jù)為1000次。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的菌株及GenBank登錄號(hào)Tab.1 Strains used for phylogenetic analysis,along with their corresponding GenBank accession numbers

..致病性測(cè)定

采用刺傷接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。將純化的菌株分別接種于PDA平板上，于25 ℃培養(yǎng)7 d，收集無(wú)性孢子并用無(wú)菌水懸浮，稀釋至終濃度10個(gè)/mL，取1年生健康黃連植株表面消毒后，用無(wú)菌接種針在葉片表面進(jìn)行刺傷，采用噴霧法，將菌株的分子孢子懸浮液噴灑于刺傷處，以不接種的健康黃連作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于溫度25 ℃、相對(duì)濕度70%、光周期12 L∶12 D的條件下恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況，并對(duì)發(fā)病葉片再次進(jìn)行病菌分離和鑒定。

1.3 殺菌劑敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，打取直徑5 mm菌餅置于含不同藥劑濃度 (表2)的PDA平板中央，以不添加藥劑的PDA平板作對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)7d，采用十字交叉法量取菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。使用Excel和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

黃連是一種連作草本植物，在第4到第6年收獲。2018-2019年，對(duì)重慶市石柱縣約7公頃的黃連田塊進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)炭疽病在田間普遍存在，在黃連種植期均能發(fā)生。該病害主要危害黃連葉片，田間發(fā)病率為10%～100%，產(chǎn)量損失為10%～30%。5-6月雨水多時(shí)，發(fā)病尤其嚴(yán)重。發(fā)病前期葉片上產(chǎn)生零星病斑，圓形或橢圓形，產(chǎn)生油漬狀的小點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大為褐色病斑，病斑中間灰白色，并著生小黑點(diǎn)(圖1)，后期病斑連成一片，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)全葉枯死并引起黃連植株枯萎，嚴(yán)重影響黃連品質(zhì)和產(chǎn)量。

2.2 病原菌分離結(jié)果

根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征，從3份患病黃連樣本中共分離出2株炭疽菌，形態(tài)、分子鑒定結(jié)果均一致，經(jīng)致病性測(cè)定均能使黃連葉片發(fā)病，將其中1株命名為HL8，用于后續(xù)研究。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

如圖2所示，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃光照培養(yǎng)，菌落以1.1 cm/d的速度生長(zhǎng)，在7 d后，菌落直徑達(dá)8 cm。PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，氣生菌絲白色薄絨狀，菌落生長(zhǎng)后期可產(chǎn)生黑色分生孢子堆，分生孢子近橢圓形，無(wú)隔膜，大小為 (19.35～40.62) μm×(5.32～9.20) μm。附著孢單生，光滑，近梨形或倒梨形，(13.20～16.82) μm×(7.53～9.78)μm。它的菌落形態(tài)、分生孢子盤及分生孢子與已報(bào)道的博寧炭疽菌 ()形態(tài)一致。

表2 5種供試殺菌劑Tab.2 Five fungicides used in the experiment

圖1 黃連炭疽病的癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose on goldthread

注：A-B:菌落形態(tài)(正反面)；C:子實(shí)體；D:分子孢子；E-F:附著胞。標(biāo)尺：D-F = 10 μm。圖2 菌株HL8的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain HL8

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將獲得的供試菌株的、、-和基因序列提交至Genbank，序列登錄號(hào)分別為MN542218，MN542219，MN542220和MN542221，并以此構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，供試菌株HL8與菌株CBS123755聚集于一支，且支持率達(dá)96%，能與其他種明顯區(qū)分開。將4個(gè)基因序列同菌株CBS123755(JQ005153、JQ005240、JQ005501和JQ005327)進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)、、-和基因的同源性分別為99.42% (512/515核苷酸)、100% (251/251核苷酸)、99.27% (273/275核苷酸)和99.29% (278/280核苷酸)。因此，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定，將病原菌鑒定為博寧炭疽菌 ()。

圖3 基于ITS、GADPH、CHS-1和ACT基因序列構(gòu)建的菌株HL8的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HL8 based on ITS、GADPH、CHS-1 and ACT concatenated sequences

2.5 致病性測(cè)定

如圖4所示，接種后的葉片在25 ℃保濕培養(yǎng)48 h后開始出現(xiàn)癥狀，5 d后呈褐色病斑，對(duì)照未發(fā)病。從接種發(fā)病的葉片中再次分離得到的菌株與原接種菌株相同，表明該菌株為致病菌，可通過(guò)傷口侵染。

2.6 殺菌劑敏感性測(cè)定

供試的5種殺菌劑對(duì)病原菌均有不同程度的抑制作用，其中，異菌脲·氟啶胺和多菌靈抑制效果最好，EC值分別為0.30 μg/mL和0.46 μg/mL；其次為百菌清和精甲霜靈·代森錳鋅，EC值分別為13.27 μg/mL和37.89 μg/mL；再次為嘧菌酯·代森聯(lián)，EC值為84.66 μg/mL(表3)。

注：A:發(fā)病植株; B:CK,健康植株。圖4 接種第5天發(fā)病情況Fig.4 Colletotrichum boninense caused anthracnose symptoms through an artificial infection test at fifth day after inoculation

表3 5種殺菌劑對(duì)Colletotrichum boninense的抑制效果Tab.3 Inhibitory effect of five fungicides against Colletotrichum boninense

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃連的研究主要集中于種質(zhì)資源和藥用價(jià)值，關(guān)于病害的研究報(bào)道較少，近年來(lái)在重慶地區(qū)由于規(guī)模化種植以及連作障礙，造成黃連病害日益加重，黃連炭疽病就是其中常見的主要病害之一。本研究從重慶石柱黃連種植基地分離典型炭疽病發(fā)病黃連植株，經(jīng)致病性測(cè)定、柯赫氏法則驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，將菌株HL8鑒定為博寧炭疽菌()。博寧炭疽菌可以危害太子參、油茶、滇黃精等植物，引起葉片壞死、腐爛、葉枯等。本研究首次報(bào)道了由博寧炭疽菌()引起的在重慶市石柱縣嚴(yán)重發(fā)生的黃連炭疽病，與之前報(bào)道的引起湖北省恩施市板橋鎮(zhèn)黃連炭疽病的病原菌一致。

目前對(duì)該病害的防治措施主要是田間管理和化學(xué)藥劑防治。合理密植，增強(qiáng)透光、透風(fēng)條件，集中深埋或燒毀病殘?bào)w等阻斷初侵染源的手段可有效預(yù)防黃連炭疽病的發(fā)生。肟菌·戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯等常用于防治由博寧炭疽菌 ()引起的植物病害，其EC分別為1.4925 μg/mL、14.7382 μg/mL和6.8886 μg/mL。本研究的殺菌劑室內(nèi)敏感性測(cè)定表明異菌脲·氟啶胺在EC值等于0.30 μg/mL時(shí)，抑菌效果最好，且均小于與市場(chǎng)常用防治藥劑的EC值，因此可作為大田藥劑進(jìn)一步研究。

本研究首次報(bào)道黃連炭疽病的病原菌為博寧炭疽菌()，為該病害的識(shí)別和防治提供理論基礎(chǔ)和參考意見。