鑒別布魯菌S2疫苗株的雙重實時熒光PCR方法的建立與應(yīng)用

董 浩，原 霖，趙明海，劉 巍，許中衎，沈子瑩，徐 陽，王傳彬*，梁春南*

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102600；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

布魯菌病(簡稱布病)是由布魯菌(Brucellaspp.)感染而引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病。布魯菌主要侵害患病動物的生殖系統(tǒng)，以母畜發(fā)生流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征。人感染布病以發(fā)熱、乏力、流產(chǎn)、睪丸炎等為主要癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至喪失勞動能力和生育能力。布病感染人類時，需要及時進(jìn)行抗生素治療，若治療不及時則容易轉(zhuǎn)變成慢性感染[1]。

疫苗免疫是流行率較高的地區(qū)控制布魯菌病最有效的方法之一。根據(jù)原農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)計委印發(fā)的《國家布魯菌病防治計劃(2016—2020年)》的相關(guān)規(guī)定，對一類地區(qū)的牛羊場群采取全面免疫，奶畜原則上不免疫的措施[2]。我國目前使用的布病疫苗主要有布魯菌A19疫苗、布魯菌S2疫苗和布魯菌M5疫苗。其中布魯菌S2疫苗是使用最多的布病疫苗，同時也是唯一一種可以對懷孕動物進(jìn)行免疫的疫苗[3]。

動物布病的檢測主要以血清學(xué)檢測方法為主，但是現(xiàn)有血清學(xué)檢測方法與大腸桿菌、耶爾森菌的部分血清型存在交叉反應(yīng)，同時我國所使用的布病疫苗所產(chǎn)生的免疫抗體和野毒株自然感染抗體無法進(jìn)行區(qū)分[4]。

實時熒光PCR技術(shù)(real-time PCR，RT-PCR)是一種對基因組進(jìn)行檢測的相對定量技術(shù)，該技術(shù)目前已廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量以及動物病原體的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫、生物制品的檢測等領(lǐng)域。早期的相關(guān)研究，也有多篇基于實時熒光PCR技術(shù)建立布魯菌病分子檢測方法并進(jìn)行臨床應(yīng)用的相關(guān)報道[5-7]。

2016年，DI等[8]對布魯菌S2疫苗株和豬種布魯菌1330株進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。同一年，紅梅[9]也對布魯菌S2疫苗株的全基因組序列進(jìn)行了測序分析，并嘗試表達(dá)差異基因編碼的蛋白，從而建立相應(yīng)的血清學(xué)鑒別診斷方法。在本研究中，擬基于布魯菌S2疫苗株和其他種布魯菌的差異序列，建立一種準(zhǔn)確、特異、快速地鑒別布魯菌S2疫苗株的實時熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與基因組模板羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308、豬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1330、犬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株的基因組均由國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈；大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；GoTag Probe qPCR Master Mix，購自Promega公司；TE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶購自NEB公司。GeneRotex全自動旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀購自西安天隆科技有限公司；NanoDrop2000和ABI7500實時熒光PCR儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1引物及探針的設(shè)計 根據(jù)早期文獻(xiàn)對于豬種布魯菌S2疫苗株基因組的分析結(jié)果[10]，以及GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308、豬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1330、犬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株的基因組序列，設(shè)計了1對特異性引物和1條探針(S2-F/R/Probe)，用于鑒別S2疫苗株與其他種布魯菌菌株。參考早期文獻(xiàn)中設(shè)計的IS711特異性引物和探針作為檢測布魯菌的通檢引物探針(Bru-F/R/Probe)[11]。引物和探針序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和探針序列詳見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 基于豬種布魯菌S2疫苗株的特異性缺失序列，設(shè)計相應(yīng)的特異性引物S2-F(BamHⅠ)和S2-R(EcoRⅠ)，以牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308株為模板，PCR擴增長度為314 bp的目的片段。PCR擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min?；厥漳康臄U增片段，經(jīng)過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，克隆入pUC19載體。挑取PCR檢測為陽性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC-S2。將含有pUC-S2陽性質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pUC-S2。利用Nanodrop2000測定質(zhì)粒的濃度，換算質(zhì)?？截悢?shù)。使用TE緩沖液對陽性質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

以牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308株為模板，PCR擴增布魯菌保守的IS711插入序列中長度為463 bp的目的片段，引物序列見表1。PCR擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min?；厥漳康臄U增片段，經(jīng)過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，克隆入pUC19載體。挑取PCR檢測為陽性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC-IS711。將含有pUC-IS711陽性質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pUC-IS711。利用Nanodrop2000測定質(zhì)粒的濃度，換算質(zhì)?？截悢?shù)。使用TE緩沖液對陽性質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.3雙重實時熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用矩陣法進(jìn)行實時熒光PCR擴增，篩選引物和探針的搭配濃度，以獲得最佳的擴增效果。

1.3.4雙重實時熒光PCR特異性試驗 分別以大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等滅活細(xì)菌核酸為模板進(jìn)行雙重實時熒光PCR 檢測，并設(shè)置1個牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308核酸陽性對照和1個空白對照(水)。同時，分別以羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308、豬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1330、犬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RM6/66、布魯菌A19疫苗株和布魯菌S2疫苗株滅活細(xì)菌核酸為模板進(jìn)行雙重實時熒光PCR 檢測，同時設(shè)置1個空白對照(水)。

1.3.5雙重實時熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別將1.3.2中構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC-IS711和pUC-S2，使用TE緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，模板濃度為1×106，1×105，1×104，1×103，1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實時熒光PCR檢測，用ABI7500熒光定量PCR儀配套軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6雙重實時熒光PCR敏感性試驗 分別將1.3.2中構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC-IS711和pUC-S2使用TE緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，模板為濃度為1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101，1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個稀釋度做3個重復(fù)，進(jìn)行實時熒光PCR檢測，以測定該雙重實時熒光PCR方法的敏感性。

1.3.7重復(fù)性試驗 分別采用濃度為1×106，1×104，1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光PCR試驗，每個濃度的模板分別進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)3個和3次批間重復(fù)試驗，以評估所建立方法的重復(fù)性。

1.3.8臨床樣品檢測 分別采用建立的雙重實時熒光PCR方法，對國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈的92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子核酸樣品(對應(yīng)流產(chǎn)奶牛的布病抗體均為陽性)，及本實驗室采集的S2疫苗陰道免疫綿羊的組織臟器樣品進(jìn)行檢測。同時，用現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)(NY/T 1467-2007)的套式PCR方法對上述樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建以牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308株為模板，PCR擴增布魯菌保守的IS711插入序列和S2疫苗株缺失序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，分別在463和314 bp出現(xiàn)和預(yù)期相符的目的條帶。2種PCR產(chǎn)物回收后分別克隆入pUC19載體，經(jīng)過PCR鑒定和測序分析發(fā)現(xiàn)，2個重組質(zhì)粒(pUC-IS711和pUC-S2)構(gòu)建成功。

2.2 雙重實時熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過體系優(yōu)化，雙重實時熒光PCR的最佳反應(yīng)體系為20.0 μL：GoTaq?Probe qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L 的上、下游引物各 0.6 μL，10 μmol/L 的探針各0.6 μL，DNA 模板 2.0 μL，加入無核酸酶的水補齊 20.0 μL。反應(yīng)程序確定為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。每個循環(huán)第 2 步，60℃ 1 min，分別收集FAM和VIC熒光信號。

提取pUC-IS711和pUC-S2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，換算拷貝數(shù)后分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板，采用優(yōu)化好條件的雙重實時熒光PCR進(jìn)行擴增。試驗結(jié)果顯示，在使用1×106～1×102拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板時，布魯菌IS711通檢熒光的擴增效率E=99.648%，R2值為0.999(圖1A)；布魯菌S2疫苗缺失序列熒光擴增效率E=99.830%，R2值為1.000(圖1B)。

A.使用pUC-IS711標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.使用pUC-S2標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗分別以羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308、豬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1330、犬種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RM6/66、布魯菌A19疫苗株、布魯菌S2疫苗株、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的核酸作為模板，同時以ddH2O為陰性對照，采用優(yōu)化好條件的雙重實時熒光PCR進(jìn)行擴增。試驗結(jié)果顯示，布魯菌S2疫苗株出現(xiàn)1條S型特異性擴增曲線(圖2A)，其他布魯菌均出現(xiàn)2條S型特異性擴增曲線。受篇幅限制只展示羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M(圖2B)。非布魯菌的其他細(xì)菌核酸樣品均未出現(xiàn)特異性的擴增曲線。

A.S2疫苗株核酸的擴增曲線；B.羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株16M核酸的擴增曲線

2.4 敏感性試驗結(jié)果為了測試雙重實時熒光PCR敏感性，將pUC-IS711和pUC-S2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板，采用優(yōu)化好條件的雙重實時熒光PCR進(jìn)行擴增。試驗結(jié)果顯示，布魯菌IS711通檢熒光的最低檢測限為1×101拷貝/μL，布魯菌S2疫苗缺失序列熒光的最低檢測限為1×101拷貝/μL(圖3)。

A.不同濃度pUC-IS711標(biāo)準(zhǔn)品的擴增結(jié)果(a～g.1×106～1×100 拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品)；B.不同濃度pUC-S2標(biāo)準(zhǔn)品擴增結(jié)果(1～7.1×106～1×100 拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品)

2.5 重復(fù)性試驗為了測試雙重實時熒光PCR的重復(fù)性，分別采用濃度為1×106，1×104，1×102拷貝/μL的2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗。結(jié)果如表2所示，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于3%，這說明建立的雙重實時熒光PCR具有良好的重復(fù)性。

表2 雙重實時熒光PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗

2.6 臨床樣品檢測利用建立的雙重實時熒光PCR對國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈的92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子核酸樣品，及本實驗室采集的20份S2疫苗陰道免疫綿羊的組織臟器樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，92份臨床流產(chǎn)奶牛陰道拭子樣品，雙重實時熒光檢出87份陽性(均為非S2疫苗株的布魯菌)，套式PCR檢測出53份陽性。20份S2疫苗陰道免疫綿羊的組織臟器樣品，雙重實時熒光PCR和套式PCR均檢出了20份陽性，而且采用雙重實時熒光PCR成功鑒別出這20份樣品中的布魯菌核酸為S2疫苗株(表3)。

表3 雙重實時熒光PCR和套式PCR檢測臨床樣品的比較 份

3 討論

由于我國目前使用的A19、S2和M5布病疫苗都具有完整的脂多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致使用上述疫苗免疫家畜后產(chǎn)生的免疫抗體與野毒株感染的抗體無法區(qū)分，這也是困擾我國乃至全球絕大多數(shù)國家布病防控的一個瓶頸。

根據(jù)《布魯菌病防治技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定，為了排除疫苗免疫抗體的干擾，S2、M5、A19菌苗免疫接種過的動物，在接種后18個月(豬接種后6個月)才能通過血清學(xué)檢測判定動物是否感染野毒菌株。然而，如此長的時間周期顯然不符合動物疫病防控的“早、快、嚴(yán)、小”的原則，也不利于及時剔除群體中的傳染源。雖然有文獻(xiàn)報道，可以采用半抗原-瓊擴試驗的方法對S2疫苗免疫的羊可以從血清學(xué)水平實現(xiàn)一定程度的鑒別診斷[13]。但是由于該方法目前應(yīng)用范圍有限，真實鑒別效果有待通過更多試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多布魯菌的全基因組序列被測并上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，這使得通過比較基因組學(xué)篩選疫苗株特定的診斷靶標(biāo)成為可能。2012年，譚鵬飛等[14]經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，NCBI上發(fā)表的豬種布魯菌疫苗株基因組序列存在25 bp的缺失?；谠撎卣餍匀笔卧O(shè)計特異性的引物，并結(jié)合布魯菌AMOS-PCR方法中的豬種1型特異性引物，他建立了雙重PCR檢測方法。該雙重PCR方法的判定標(biāo)準(zhǔn)：同時出現(xiàn)500和285 bp 2條帶，判為疫苗株陽性；沒帶均判為疫苗株S2陰性，即非疫苗株S2；若出現(xiàn)285 bp單一條帶判為豬種布魯菌1型菌株。采用此方法可以實現(xiàn)對S2疫苗株的鑒別診斷。2015年，張巖[10]也基于S2疫苗株在iclR基因的缺失序列，設(shè)計核酸長度為29 bp的寡核苷酸探針，并用地高辛進(jìn)行標(biāo)記，最低能夠檢測到10 pg的PCR片段，能夠在10 h內(nèi)鑒別出布魯菌S2疫苗株。

相比上述2個采用雙重PCR和斑點雜交的方法進(jìn)行布魯菌S2疫苗株的鑒別，本研究同樣也是基于S2疫苗株iclR基因的缺失序列設(shè)計了1套對S2疫苗株進(jìn)行鑒別的引物及探針，配合布魯菌IS711通檢引物和探針，實現(xiàn)對S2疫苗株的鑒別診斷。本研究建立的雙重實時熒光PCR對布魯菌的通檢和S2疫苗株鑒別的最低檢測限都可達(dá)到10 拷貝/μL，敏感性比上述雙重PCR和斑點雜交方法均有所顯著提升，操作也更加簡便。而且，實時熒光PCR技術(shù)更容易在分子檢測實驗室中推廣使用。除此之外，本研究建立的雙重實時熒光PCR不與常見的牛羊病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，臨床樣品檢測效果也優(yōu)于目前我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的套式PCR方法，在處理拭子等細(xì)菌含量較低的樣品時，優(yōu)勢更加明顯。綜上所述，本研究建立了一種可以對布魯菌S2疫苗株進(jìn)行鑒別診斷的雙重實時熒光PCR方法，其有著比較理想的敏感性、特異性和重復(fù)性，可用于臨床家畜組織樣品布魯菌核酸的有效檢測，對我國布病的早期診斷和綜合防控具有較大意義。