中國荷斯坦奶牛GPR120基因SNP位點鑒定及其與產(chǎn)奶性能的關聯(lián)分析

鄒紫雯，羅 林，劉 娟，韓 碩，李鑫麗，宛 麟，王斯琦，趙志輝，沈冰蕾*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.廣東海洋大學 農(nóng)學院，廣東 湛江 524088)

隨著世界人口的劇增，牛奶及牛奶衍生品在世界各地正飛速擴張，牛奶及其衍生品具有人體所需的維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，且物美價廉極容易吸收等特點，顯然已成為人類不可或缺的食物。由于全世界對牛奶消費量的激增，產(chǎn)奶量需求增加，相應的牛奶中的營養(yǎng)品質(zhì)逐漸降低，因此研究人員也在時刻關注牛奶的品質(zhì)控制與改良，而乳脂是乳品質(zhì)調(diào)控的主要目標性狀，也是評價牛奶質(zhì)量高低反映奶產(chǎn)品行業(yè)經(jīng)濟效益的主要指標之一。牛奶中乳脂合成所需的脂肪酸主要來源于以下2個部分：第1部分為乳腺上皮細胞利用乙酸、β-羥丁酸等前體物質(zhì)在乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha,ACC1)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的催化下進行脂肪酸從頭合成。第2部分為食物消化吸收的長鏈脂肪酸，借助載脂蛋白從血液中攝取[1]。而影響乳脂率的因素主要為日糧配方、品種因素、遺傳背景、生理病理因素、氣候條件等[2]。其中在個體間影響牛奶中乳脂差異的主要因素為乳脂合成及調(diào)控相關基因的遺傳多態(tài)性。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs) 作為最大的膜結(jié)合受體家族，其家族成員能夠與許多激素、神經(jīng)肽、趨化因子或化學傳感器結(jié)合而引起信號轉(zhuǎn)導[3]。GPR120是G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs中被較晚發(fā)現(xiàn)的一員，其作為受體蛋白能夠被內(nèi)源性和膳食游離脂肪酸(FFA)激活從而參與一系列的代謝反應及炎癥過程[4]。在肝臟代謝中，KAZUO等[5]研究表明，通過二十二碳六烯酸(DHA)激活GPR120抑制了飼喂CDAHF(0.1%蛋氨酸和膽堿缺乏高脂肪)小鼠體內(nèi)炎性細胞因子，并防止了纖維化，預防了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的產(chǎn)生。在癌癥方面，GPR120基因可以調(diào)控腫瘤細胞的生長增殖、細胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥[6]。此外研究者發(fā)現(xiàn)，在食道癌組織中GPR120的表達顯著高于正常組織，且敲低GPR120后顯著降低體外食道癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并降低體內(nèi)腫瘤生長[7]。而近年來越來越多的研究表明GPR120在脂代謝中起重要作用。WANG等[8]證實了9-PAHSA(一種內(nèi)源性哺乳動物脂類)通過激活GPR120來抑制LPS/NF-kB途徑從而誘導脂肪細胞的褐變。也有研究指出，GPR120在3T3-L1脂肪細胞中通過Ca2 +和ERK1/2信號途徑增加PPARγ的表達來促進脂肪形成[9]。由于GPR120在脂肪代謝多個環(huán)節(jié)中起重要作用，其受到越來越廣泛的關注。近年來，GPR120在脂代謝中的研究多集中在脂肪組織及脂肪細胞，而關于GPR120在奶牛乳脂合成中的作用及GPR120基因多態(tài)性的研究仍較少見。

因此，本研究以黑龍江省某規(guī)?；龅闹袊伤固鼓膛樵囼炄后w，采用PCR-RFLP方法開展GPR120基因單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism site，SNP)的鑒定，并對其進行生物信息學分析及產(chǎn)奶性能相關性分析，為奶牛乳脂代謝相關候選分子輔助選擇標記的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集本試驗采用來自黑龍江省綏化市某牛場的有效(具備連續(xù)3年完整的DHI跟蹤數(shù)據(jù))中國荷斯坦奶牛518頭為試驗群體，每頭牛尾靜脈采血10 mL，并用檸檬酸鈉抗凝處理，放于4℃保存。

1.2 基因組DNA提取奶牛血液基因組DNA提取采用DNA試劑盒(北京天根生化有限公司)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，并用紫外分光光度計法測定DNA濃度，保證DNA濃度在最適范圍內(nèi)，置于-20℃保存。

1.3 引物設計與PCR擴增外顯子區(qū)域的SNP很大程度上會引起氨基酸結(jié)構發(fā)生改變,進而改變基因的翻譯。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的牛(Bostaurus)GPR120基因序列(登錄號：NM_001328657.1)設計4段GPR120基因3個外顯子的特異性引物，引物信息見表1。引物序列由哈爾濱擎科生物有限公司進行合成。

表1 中國荷斯坦奶牛GPR120基因外顯子引物序列

PCR擴增總體系為25.0 μL：DNA混池模板1.0 μL，上、下游引物各1.00 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O補充至體系25.0 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；35個循環(huán)×(94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用0.1%瓊脂糖凝膠電泳0.5 h后用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。

1.4 序列測定與分析選擇擴增效果良好的 PCR 產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物有限公司進行純化后雙向測序。使用Chromas軟件、MEGA6軟件對測序結(jié)果進行拼接，篩選中國荷斯坦奶牛GPR120基因3個外顯子的SNP位點。

1.5 PCR-RFLP分析以每頭牛血液的DNA為模板分別進行PCR擴增，擴增后進行RFLP 分析。酶切反應體系：限制性內(nèi)切酶 1 μL，10×T Buffer 2 μL,0.1% BSA 2 μL，DNA 8 μL，滅菌水 7 μL。30℃下反應1 h。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等位基因頻率計算公式：

PA=(2×AA+AB)/2N；PB=1-PA(PA表示等位基因 A 的頻率，A 表示等位基因；PB 表示等位基因 B 的頻率，B 表示等位基因；AA 表示該基因型個數(shù)，AB 表示 AB 基因型個數(shù)；N 表示總數(shù))。

基因型頻率的計算公式：基因型頻率=(基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù))×100%。

多態(tài)信息含量的計算公式：

雜合度計算公式：

純合度計算公式：

Ho=1-He。

有效等位基因數(shù)計算公式：

1.7 連鎖分析使用 SHEsis 軟件檢測GPR120基因SNP之間的連鎖不平衡(LD)。

2 結(jié)果

2.1 中國荷斯坦奶牛GPR120基因PCR擴增結(jié)果圖1為GPR120基因第1外顯子的PCR擴增結(jié)果，以1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其片段長度分別為565，935 bp。圖2為GPR120基因第2外顯子的PCR擴增結(jié)果，其片段長度為375 bp。圖3為GPR120基因第3外顯子的PCR擴增結(jié)果，其片段長度為985 bp。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物電泳條帶清晰，特異性效果較好，結(jié)果與預期片段大小一致，可以用于后續(xù)測序分析。

M.DL2000 DNA Marker;1～3. GPR120基因第1外顯子片段1；4～6. GPR120基因第1外顯子片段2

M.DL600 DNA Marker;1～3.GPR120基因第2外顯子

M.DL2000 DNA Marker;1～3.GPR120基因第3外顯子

2.2 中國荷斯坦奶牛GPR120基因SNP檢測利用Chromas軟件和MEGA6軟件對GPR120第一外顯子的測序結(jié)果進行拼接，并篩選出SNP位點，結(jié)果顯示中國荷斯坦奶牛GPR120基因第一外顯子存在9個SNP位點，分別為T100G、C196T、G413A、C428T、G713T、C858G、T873G、G903T、C904T，其中T100G由色氨酸(Trp)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，G413A位點使甘氨酸(Gly)突變?yōu)楣劝彼?Glu)，C428T位點使絲氨酸(Ser)突變?yōu)楸奖彼?Phe)，C904T位點使亮氨酸(Leu)突變?yōu)楸奖彼?Phe)(圖4)。而第二外顯子及第三外顯子并未鑒定出SNP位點。

圖4 GPR120 基因測序結(jié)果及 SNP 位點

2.3 中國荷斯坦奶牛GPR120基因mRNA二級結(jié)構預測運用在線程序(RNA fold web server服務器)預測中國荷斯坦奶牛GPR120基因T100G、G413A、C428T、C904T位點的mRNA二級結(jié)構。

突變前mRNA二級結(jié)構最小自由能為-1 891.17 kJ/mol，而突變后的T100G位點mRNA二級結(jié)構最小自由能為-1 904.98 kJ/mol，最小自由能有所降低;G413A位點mRNA二級結(jié)構最小自由能為-1 882.80 kJ/mol，最小自由能有所升高;C428T位點mRNA二級結(jié)構最小自由能為-1 889.91 kJ/mol，最小自由能有所升高;C904T位點mRNA二級結(jié)構最小自由能為-1 904.98 kJ/mol，最小自由能有所降低。如圖5所示mRNA的二級結(jié)構穩(wěn)定性可能產(chǎn)生改變，從而對蛋白質(zhì)的翻譯發(fā)生影響。

圖5 中國荷斯坦奶牛GPR120基因SNP位點二級結(jié)構突變前后對比

2.4 中國荷斯坦奶牛GPR120基因蛋白二級結(jié)構預測由圖6可知中國荷斯坦奶牛GPR120基因的T100G、G413A、C428T、C904T位點為錯義突變，運用在線程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl)預測發(fā)現(xiàn)突變前后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構發(fā)生輕微改變。

圖6 中國荷斯坦奶牛GPR120蛋白二級結(jié)構突變前后對比

結(jié)果顯示，突變前蛋白質(zhì)二級結(jié)構：a-螺旋(h)占34.77%，β-折疊(e)占15.08%，無規(guī)則卷曲(c)占44.62%。突變后T100G位點蛋白質(zhì)二級結(jié)構：a-螺旋(h)占35.38%，β-折疊(e)占16.62%，無規(guī)則卷曲(c)占42.77%。突變后G413A位點蛋白質(zhì)二級結(jié)構：a-螺旋(h)占34.77%，β-折疊(e)占15.08%，無規(guī)則卷曲(c)占44.62%。突變后C428T位點蛋白質(zhì)二級結(jié)構：a-螺旋(h)占35.38%，β-折疊(e)占15.08%，無規(guī)則卷曲(c)占43.69%。突變后C904T位點蛋白質(zhì)二級結(jié)構：a-螺旋(h)占34.46%，β-折疊(e)占15.08%，無規(guī)則卷曲(c)占44.92%。

由結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，a-螺旋的蛋白質(zhì)二級結(jié)構T100G、C428T、C904T 3個位點突變前后的含量分別增加了0.61%、增加了0.61%、減少了0.31%。β-折疊僅T100G位點增加了1.54%。無規(guī)則卷曲的含量在突變前后T100G位點減少了1.85%，C428T位點減少了0.93%，C904T位點增加了0.30%。無規(guī)則卷曲在GPR120基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構的編碼過程中起到主導作用，當無規(guī)則卷曲發(fā)生改變后，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就會發(fā)生改變。

2.5 PCR-RFLP結(jié)果分析經(jīng)PCR-RFLP分析，G413A位點和T873G位點存在限制性內(nèi)切酶，因此本試驗選擇G413A、T873G 2個位點進行后續(xù)研究。

G413A位點的限制性內(nèi)切酶是SacⅡ，識別序列為CCGC/GG。通過單一DNA模板擴增的PCR產(chǎn)物進行RFLP檢測后，得到3種條帶型基因型GG、GA、AA(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.AA;2.GA;3.AA;4.AA;5.GA;6.GG;7.GG;8.GG

T873G位點的限制性內(nèi)切酶是SmaⅠ，識別序列為CCC/GGG。通過單一DNA模板擴增的PCR產(chǎn)物進RFLP檢測后，得到3種基因型TT、TG、GG(圖8)。

M.DL2000 DNA Marker;1.GG;2.GG;3.TG;4.TT;5.TT;6.TG

2.6GPR120基因SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率分析GPR120基因外顯子1片段1的G413A位點基因型頻率和等位基因頻率如表2所示，其中在群體中占主導地位的基因型為GG，基因型頻率為51.0%。在群體中占主導地位的等位基因為G，等位基因頻率為66.3%。

GPR120基因外顯子1片段2的T873G位點基因型頻率和等位基因頻率如表2所示，其中在群體中占主導地位的基因型為TT，基因型頻率為55.1%。在群體中占主導地位的等位基因為T，等位基因頻率為67.3%。

表2 GPR120基因 SNP 位點基因型頻率和等位基因頻率

2.7GPR120基因SNP位點的遺傳參數(shù)分析中國荷斯坦奶牛GPR120基因G413A、T873G突變位點的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)，如表3所示，其中G413A、T873G位點多態(tài)性信息含量(PIC)分別為0.347和0.343，數(shù)值在0.250～0.500之間，表明2個SNP位點為中度多態(tài)性。

表3 GPR120基因 SNP 位點在群體中的遺傳參數(shù)分析

2.8GPR120基因SNP位點與產(chǎn)奶性狀的關聯(lián)分析GPR120外顯子1的G413A、T873G突變位點與中國荷斯坦奶牛試驗牛群DHI數(shù)據(jù)中產(chǎn)奶性狀(305 d日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率)之間關聯(lián)分析結(jié)果如表4所示。

表4 GPR120基因SNP位點與中國荷斯坦奶牛DHI產(chǎn)奶性能的相關分析

G413A位點與305 d日產(chǎn)奶量及乳脂率具有顯著相關性(P<0.05)，與乳蛋白率及體細胞評分呈極顯著相關性(P<0.01)。GG基因型在群體中占主導地位，GG基因型與GA基因型的305 d日產(chǎn)奶量、乳蛋白率和體細胞評分具有顯著性差異(P<0.05)，與AA基因型體細胞評分具有顯著性差異(P<0.05)。

T873G位點與305 d日產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率具有極顯著相關性(P<0.01)。TT基因型在群體中占主導地位，TT基因型與TG基因型的305 d日產(chǎn)奶量、乳脂率具有顯著差異性(P<0.05)，與GG基因型的305 d日產(chǎn)奶量具有顯著性差異(P<0.05)。

2.9GPR120基因SNP位點連鎖分析如圖9所示，GPR120外顯子1的G413A、T873G突變位點是連鎖不平衡(G413A、T873G的D值=0.65)。

圖9 GPR120基因連鎖不平衡分析

3 討論

乳脂主要由甘油三酯組成，其以乳脂球 (milk fat globules,MFG) 的形式存在并分泌。乳脂中含有人體所需的所有必需脂肪酸及多種脂溶性維生素，同時乳脂也是決定牛奶品質(zhì)的重要因素之一[10]。影響乳脂合成的因素有很多，其中遺傳因素作為影響乳脂合成的內(nèi)在因素對乳脂合成具有較大影響。王凱等[11]研究表明TRAPPC9基因rs1100-17379、DGAT1基因rs109421300、ATP1A1基因rs110256520和GHR基因rs41639260作為多態(tài)性均對乳蛋白率和乳脂率有顯著性影響。張娟等[12]發(fā)現(xiàn)EEF1D基因存在2個SNP位點，其中EEF1D-1位點對乳脂率和乳蛋白率性狀的效應均達到極顯著水平。LIANG等[13]研究確定了中國荷斯坦奶牛ACSL1基因的6個SNP位點(5′UTR-g.20523C>G、g.35446C>T、g.35651G>A、g.35827C>T、 g.35941G>A、g.51472C>T)，它們在一定程度上與牛奶產(chǎn)量、牛奶脂肪含量、牛奶蛋白質(zhì)含量和體細胞評分(SCS)顯著相關。

近年來，GPR120基因的研究均集中在癌癥，糖尿病及肥胖癥等代謝異常疾病。SINZ等[14]研究表明二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(EPA和DHA)對3T3-L1和人皮下培養(yǎng)的脂肪細胞中TNF-α誘導的chemerin產(chǎn)生影響。chemerin是一種促炎性脂肪因子，在肥胖癥中會增加，并與肥胖相關的疾病相關。研究發(fā)現(xiàn)DHA顯著降低3T3-L1和人脂肪細胞中chemerin生成。EPA不影響chemerin的產(chǎn)生，但能減弱TNF-α對chemerin的誘導作用。而用siRNA沉默GPR120可阻斷DHA和EPA減少TNF-α誘導的chemerin分泌的能力。為了探究G蛋白偶聯(lián)受體120在食道癌中的作用，CUI等[7]研究表明，與正常組織相比，在食道癌組織中觀察到GPR120的表達顯著增加。GPR120基因敲低顯著降低了食道癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并降低了Akt磷酸化和I-κB磷酸化水平、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素8(IL-8)等炎癥相關的細胞因子的表達水平，同時降低體內(nèi)腫瘤的生長。據(jù)報道GPR120在機體肥胖、胰島素抵抗以及2型糖尿病等疾病的發(fā)生都與GPR120的功能缺陷有密切關聯(lián)。何晴雯[15]研究發(fā)現(xiàn)在妊娠32，37周，妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)組與血糖正常的妊娠組相比,白細胞中GPR120 mRNA及FGF21(成纖維細胞生長因子21) mRNA表達量明顯升高，而產(chǎn)后2 d 時，GDM組與血糖正常的妊娠組相比GPR120 mRNA及FGF21 mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義。因此在妊娠期糖尿病患者體內(nèi)可能通過調(diào)節(jié)GPR120表達量升高從而誘導FGF21 mRNA表達量升高，進一步調(diào)節(jié)GDM的發(fā)生和發(fā)展。綜上結(jié)果表明，越來越多的研究者們關注了GPR120，其在不同領域都取得了極大的研究成果。但是關于GPR120基因在家畜群體中SNP位點的研究仍較少見。

SNP即單核苷酸多態(tài)性位點是指在基因組上單個核苷酸的變異形成的遺傳標記。外顯子區(qū)域的SNP很大程度上會引起氨基酸結(jié)構發(fā)生改變， 進而改變基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。DNA混池(DNA pooling)是將幾個或多個個體的DNA按照一定比例混合后再進行PCR擴增，DNA混池與測序技術相結(jié)合,不僅在尋找突變位點上能夠大大降低試驗成本，同時還能滿足準確率高、重復性好的要求[16]。FONTANESI等[17]利用高通量離子激流半導體測序技術對豬GPR120基因進行測序，確定了3個SNP位點，其中g.114765469C>T位點與豬的平均日增重存在顯著相關。ALAN等[18]對203名兒童中GPR120的3個SNP位點(rs10882273 T>C、rs12243124 T>C和rs11187533 C>T)進行了關聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)rs11187533位點與葡萄糖水平之間存在顯著相關。此外，該位點與肝酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶顯著關聯(lián)。結(jié)果表明rs11187533單核苷酸多態(tài)性的純合子等位基因型可能對伴隨肥胖的代謝后果起到保護作用，并且可以在早期識別出代謝健康的肥胖個體。而肥胖也是犬中常見的營養(yǎng)失調(diào)疾病，但是尚未在犬中鑒定出遺傳因素。MIYABE等[19]對141只犬的GPR120基因突變進行了研究，發(fā)現(xiàn)5個同義突變和4個非同義突變。其中在40只犬中發(fā)現(xiàn)c.595C>A位點發(fā)生突變且c.595C>A位點與代謝率降低有關，因此c.595C>A位點是一個與肥胖相關的候選變異體，可能有助于犬的營養(yǎng)管理。

由于GPR120 SNP位點的研究較少，而關于GPR120基因在奶牛中的SNP研究未見報道。因此本試驗為了探究GPR120是否與乳脂等泌乳性狀的相關性，采用 PCR-RFLP方法在中國荷斯坦奶牛GPR120基因第1外顯子中篩選到9個SNP位點，其中T100G、G413A、C428T、C904T 4個位點為錯義突變，導致T100G由色氨酸(Trp)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，G413A由甘氨酸(Gly)突變?yōu)楣劝彼?Glu)，C428T由絲氨酸(Ser)突變?yōu)楸奖彼?Phe)，C904T由亮氨酸(Leu)突變?yōu)楸奖彼?Phe)，而氨基酸的改變會導致GPR120蛋白的功能發(fā)生相應的變化。因為通過二級結(jié)構預測結(jié)果顯示，T100G、C904T SNP位點的自由能相比參考序列有所增加，導致mRNA 二級結(jié)構的穩(wěn)定性降低，可能會影響基因表達效率。中國荷斯坦奶牛GPR120蛋白二級結(jié)構中無規(guī)則卷曲占主導地位，T100G無規(guī)則卷曲由44.62% 減少至49.10%,C428T無規(guī)則卷曲由44.62% 減少至43.69%，C904T無規(guī)則卷曲由44.62% 增加至44.92%,由于無規(guī)則卷曲是構成配體受體結(jié)合的活性部位，突變可能會對蛋白質(zhì)二級結(jié)構的穩(wěn)定性造成影響，從而影響蛋白質(zhì)三級結(jié)構，使蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化。

通過PCR-RFLP進一步對GPR120的9個SNP位點所產(chǎn)生的基因型進行分析。在中國荷斯坦奶牛試驗群體中G413A、T873G這2個SNP位點均檢測到3種基因型，G413A基因型為GG、GA、AA，其優(yōu)勢基因型為GG，優(yōu)勢等位基因為G。T873G基因型為TT、TG、GG，其優(yōu)勢基因型為TT，優(yōu)勢等位基因為T。在試驗群體中G413A、T873G位點多態(tài)性信息含量(PIC)分別為0.347和0.343，數(shù)值在0.250～0.500之間，表明2個SNP位點為中度多態(tài)性。將G413A、T873G 2個SNP位點與產(chǎn)奶性能進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，G413A位點與305 d日產(chǎn)奶量及乳脂率呈顯著相關(P<0.05)，與乳蛋白率及體細胞評分呈極顯著相關性(P<0.01)。T873G位點與305 d 日產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率亦呈極顯著相關(P<0.01)。由于本試驗研究所用的樣本量偏少，后期將擴大樣本量并對GPR120進行全基因組分析，同時通過奶牛乳腺上皮細胞進一步探索GPR120對奶牛乳腺發(fā)育及乳脂合成的分子作用機制。