烏魯木齊市活禽市場(chǎng)環(huán)境源H5N8亞型高致病性禽流感病毒的遺傳進(jìn)化分析

贠豐澤，阿木提喀日·馬木提，張 成,2，常娜娜，蘇斌杰，畢玉海,2，馬正海*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830046；2.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所/病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/流感研究與預(yù)警中心，北京 100101)

對(duì)高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)等重大傳染病病原的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是傳染病防控的關(guān)鍵和生物安全的重要組成部分。近年來，新疆頻繁暴發(fā)禽流感(avian influenza，AI)疫情，在新疆展開禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)監(jiān)測(cè)和病毒溯源等研究將為AI防控工作提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2010年，在江蘇活禽市場(chǎng)家鴨中檢測(cè)到H5N8 HPAIV[1]，隨后于2014年1月在韓國(guó)一養(yǎng)禽場(chǎng)再次被發(fā)現(xiàn)，并在韓國(guó)快速傳播[2]，目前，H5N8亞型HPAIV已在全球廣泛傳播，在日本、俄羅斯、德國(guó)、匈牙利、意大利、荷蘭和英國(guó)等歐洲國(guó)家以及美國(guó)均已檢出該病毒[3-5]。大量的研究表明，活禽市場(chǎng)(live poultry markets,LPM)是多種AIV亞型共存的“大熔爐”，從LPM的禽類雙腔拭子和外環(huán)境中幾乎檢測(cè)到了AIV所有亞型，LPM在AIV傳播、進(jìn)化、突變、重配等方面也均發(fā)揮了重要作用[6-9]。同時(shí)，LPM也是人感染AIV的主要源頭，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，感染HPAIV的患者大多數(shù)都有活禽暴露史[9-11]。為此，對(duì)LPM家禽和環(huán)境進(jìn)行AIV監(jiān)測(cè)是AI防控的重要環(huán)節(jié)。本研究定期采集烏魯木齊市活禽市場(chǎng)外環(huán)境樣品進(jìn)行AIV分離鑒定，對(duì)分離獲得的2株環(huán)境源H5N8 AIVs進(jìn)行全基因組測(cè)序以及遺傳進(jìn)化和分子特征分析，以探討烏魯木齊市H5N8 HPAIV的來源及其潛在的致病性，為AI防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品2016年10月至2018年12月于烏魯木齊市某LPM定期采集環(huán)境混合樣(籠具、籠具下糞便、屠宰案板、家禽飲用水和食物等)，每月1次，每次采集2～3份。樣品貯存于含多種抗生素的DMEM緩沖液中，于-20℃便攜式冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑病毒RNA純化試劑盒(BSC58S-2D)和PCR產(chǎn)物純化試劑(BSC58S2C)購自杭州博日科技有限公司；一步法RT-PCR試劑盒(RR055A)和DNA Marker購自大連TaKaRa公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TOYOBO產(chǎn)品(FSQ-201)；高保真PCR試劑盒為美國(guó)MCLab產(chǎn)品。

1.3 AIV的分離樣品管經(jīng)30 s震蕩、7 000 r/min離心5 min后，取100 μL上清接種于9～11日齡SPF雞胚尿囊腔中。37℃培養(yǎng)雞胚，24 h后每隔12 h 觀察雞胚死亡情況，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收取24 h后死亡的雞胚或72 h未死亡的雞胚尿囊液，經(jīng)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)為AIV陽性的尿囊液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AIV核酸提取從AIV陽性尿囊液中提取AIV核酸，具體操作按病毒RNA純化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 AIV的鑒定以病毒RNA為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，繼而以AIVPB1通用引物Flu-pan-PB1-F(ACIGGAGACAAIACNAAATGGAATGA)和Flu-Pan-PB1-R(ACTGTTGACAGCATITTNAACATNCCC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。最后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.6 AIV全基因組擴(kuò)增及測(cè)序?qū)IV陽性樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測(cè)序，以AIV通用引物MBTuni-12(ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG)和MBTuni-13(ACGCGAGATCAGTAGAAACAAG-G)進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增AIV全基因組8個(gè)基因片段，反應(yīng)參數(shù)為50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s,72℃ 150 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送華大基因進(jìn)行二代測(cè)序。

1.7 AIV基因序列分析分離株基因序列在GISAID和GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲取與AIV 各基因片段相似性較高的病毒株序列為參考序列，以MegAlign 軟件分析病毒各基因的同源性和突變，以MEGA-X的Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Meg Align軟件分析基因突變。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離、鑒定和基因組測(cè)序共采集LPM外環(huán)境樣品75份，其中2016、2017和2018年分別為7，35，33份，從3份樣品中分離到病毒，經(jīng)測(cè)序以及HA和NA序列分析表明，其中2株為H5N8亞型，分別由2016年10月12日和12月18日的樣品中分離；1株為H9N2亞型，自2017年3月樣品中分離。本試驗(yàn)對(duì)2株H5N8 AIVs進(jìn)行全基因組測(cè)序以及遺傳進(jìn)化和分子特征分析，2株環(huán)境源H5N8 AIVs間基因序列一致性分析表明，8個(gè)基因片段中MP、NA和NS的一致性較高，分別為99.2%，99.9%，100.0%，其他5個(gè)基因的一致性較低，為85.9%～98.1%，2株病毒存在差異，分別命名為A/Environment/Xinjiang/001/2016(H5N8)和A/Environment/Xinjiang/007/2016(H5N8)，簡(jiǎn)稱XJ/Env1/2016(H5N8)和XJ/Env7/2016(H5N8)，其全長(zhǎng)基因組8個(gè)片段的序列已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MW109845-109860。

2.2 AIV序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析分離病毒各基因片段經(jīng)BLAST比對(duì)，表1列出了與分離株各基因一致性最高的部分毒株。XJ/Env1/2016(H5N8)的8個(gè)基因片段與2016年底至2017年初自西藏、內(nèi)蒙古和江蘇等地區(qū)外環(huán)境中分離的H5N8 AIVs一致性最高，為95.21%～100.00%；另外NA和NS與2010-2012年華東地區(qū)家鴨中分離的H5N8 AIVs一致性亦為最高，分別為99.93% 和100.00%。XJ/Env7/2016(H5N8)的PB2與2011年山東野鴨中分離的H5N1 AIVs一致性最高，其余7個(gè)基因均與2016年底至2017年初自西藏和內(nèi)蒙古外環(huán)境中分離的H5N8 AIVs一致性最高，PB1和PA分別為99.08%和99.95%，其余5個(gè)基因均為100.00%；另外HA、NP、NA、MP和NS5個(gè)基因與2010-2012年華東地區(qū)家鴨中分離的H5N8 AIVs一致性亦為最高，均為100.00%。

表1 與H5N8 AIVs分離株各基因核酸一致性最高的病毒株

H5N8 AIV分離株外部和內(nèi)部基因系統(tǒng)進(jìn)化分析如圖1和2所示，根據(jù)HA的進(jìn)化分析，2株病毒均屬于Clade 2.3.4.4 Group A，2株病毒的NA和NS聚在一起，其余6個(gè)基因均聚在不同分支。同時(shí)，2株病毒各基因的進(jìn)化關(guān)系存在明顯共性，除XJ/Env7/2016(H5N8)的PB2與2010-2012年自江蘇等華東地區(qū)家鴨中分離的H5N8 AIV聚在一個(gè)分支之外，XJ/Env7/2016(H5N8)其余的7個(gè)基因以及XJ/Env1/2016(H5N8)的8個(gè)基因均與2016-2017年自江蘇、山東、山西、內(nèi)蒙古、西藏等地區(qū)外環(huán)境中分離的H5N8 AIVs聚在一起。另外，2株分離病毒多個(gè)基因與2011-2012年自華東家鴨中分離的H5N8 AIVs的遺傳距離較近。

▲.本研究分離的病毒株

2.3 AIV分子特征分析2株H5N8分離株HA蛋白裂解位點(diǎn)處序列分別為RERRRKR↓GLF(“↓”表示裂解位點(diǎn))和REKRRKR↓GLF， 均含5個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，為HPAIV的特征。分離病毒存在增強(qiáng)病毒毒力和致病力的多個(gè)突變(表2)，HA發(fā)生S137A和T160A突變，可增強(qiáng)病毒與哺乳動(dòng)物SA α2,6-Gal受體結(jié)合的親和力[16-17]，PB2的L89V、PB1的I368V、PB1-F2的N66S、NS1的P42S以及M1的N30D和T215A等突變可增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠等哺乳動(dòng)物的毒力和致病力均已見報(bào)道[12-15,18-20]。

表2 H5N8 AIVs分離株中與致病力相關(guān)的突變

3 討論

新疆自2005年以來接連發(fā)生H5N1亞型高致病性AI疫情，且近年連續(xù)發(fā)生多種亞型的AI疫情，并出現(xiàn)人感染H7N9 AIV病例[21]。2016年開始進(jìn)入頻發(fā)期，尤其是2019年底至2020年初，新疆多個(gè)地區(qū)接連發(fā)生多起遷徙天鵝感染HPAIV的疫情[22]。大量的研究表明，LPM往往是多種AIV亞型共存的“大熔爐”，是人感染AIV的主要源頭[6-11]。為此，對(duì)LPM中家禽和外環(huán)境定期進(jìn)行AIV監(jiān)測(cè)是AI防控的重要環(huán)節(jié)。本研究于2016年10月至2018年12月持續(xù)采集烏魯木齊某大型LPM外環(huán)境樣品進(jìn)行AIV分離鑒定，分別自2016年冬季樣品中分離到2株H5N8 AIVs，自2017年春季樣品中分離到1株H9N2 AIV，說明該市LPM外環(huán)境存在AIV污染，王六合等[23]亦報(bào)道烏魯木齊市LPM活禽和外環(huán)境中AIV陽性率較高，故尚需要加強(qiáng)對(duì)LPM進(jìn)行定期消毒和持續(xù)監(jiān)測(cè)，以降低AIV通過活禽交易傳播的風(fēng)險(xiǎn)。另外，2017年4月至2018年12月采集的樣品中均未分離到AIV,其與2016年底至2017年初烏魯木齊市逐步將活禽交易集中于指定LPM并加強(qiáng)管理和監(jiān)督有關(guān)，說明LPM每日清洗、每周休市1 d集中消毒等監(jiān)管措施有效地消殺了環(huán)境中的AIV。

自2010年華東地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)新的H5N8 AIV(A/duck/Jiangsu/k1203/2010)以來[1]，其已快速傳播至多個(gè)地區(qū)并引發(fā)禽流感疫情。據(jù)報(bào)道目前流行的H5N8 AIVs是家禽“HPAI H5Ny和HxN8”循環(huán)至野鳥時(shí)發(fā)生重配而產(chǎn)生[24]，且H5N8 AIV可隨候鳥遷徙而廣泛傳播[25]。本研究分離的2株環(huán)境源H5N8 AIV在序列一致性和進(jìn)化關(guān)系方面存在差異，同時(shí)也存在明顯的共性。2株H5N8 AIVs各基因片段中，XJ/Env7/2016(H5N8)的PB2與山東地區(qū)野鳥源H5N1 AIVs一致性最高，其余基因片段均與2016年底至2017年初自西藏、內(nèi)蒙古和江蘇等地區(qū)外環(huán)境中分離的H5N8 AIVs一致性最高，且部分基因與2010-2012年華東地區(qū)家鴨中分離的H5N8 AIVs一致性亦為最高。遺傳進(jìn)化分析表明，除XJ/Env7/2016(H5N8)的PB2與2010-2012年自華東家鴨中分離的H5N8 AIVs聚在1個(gè)分支之外，2株病毒其余各基因均與2016-2017年自江蘇、山東、山西、內(nèi)蒙古、西藏等地區(qū)外環(huán)境中分離的H5N8 AIVs聚在一起，同時(shí)病毒多個(gè)基因與2011-2012年自華東家鴨中分離的H5N8 AIVs的遺傳距離較近。以上結(jié)果說明烏魯木齊市LPM 環(huán)境源H5N8 AIVs與2016-2017年我國(guó)多個(gè)地區(qū)流行的H5N8 AIVs毒株進(jìn)化關(guān)系密切，且多個(gè)基因源于2010-2012年華東地區(qū)家禽中流行的毒株。新疆是全球候鳥遷徙的重要通道，通過途徑的“中亞―印度線”和“東非―西亞線”遷徙線與西伯利亞、蒙古國(guó)、印度半島以及國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)連接，AIVs隨候鳥遷飛傳入新疆的風(fēng)險(xiǎn)較高，前期我們?cè)谠搮^(qū)域野鳥糞便中分離到多種亞型AIVs[26]，近幾年新疆多個(gè)地區(qū)接連發(fā)生多起遷徙候鳥感染AIVs的疫情[22]。本研究中XJ/Env7/2016(H5N8)的PB2與野鴨源H5N1 AIVs病毒株遺傳距離較近，2株分離病毒的HA、NA、PA也與多個(gè)野鳥源病毒株的遺傳距離較近，說明分離病毒的一些基因源于野鳥，且2016年底和2017年初多個(gè)地區(qū)分離的環(huán)境源H5N8 AIVs間遺傳距離較近，說明這些毒株的分布地域極為廣泛，可能是通過遷徙候鳥的跨地域快速傳播所引起的。

2株分離病毒的HA裂解位點(diǎn)均含5個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，為HPAIV；受體結(jié)合位點(diǎn)226，228位未發(fā)生突變，保留為Q和G，傾向于結(jié)合禽類α2,3半乳糖苷唾液酸(SAα2,3-Gal)受體，而S137A和T160A突變可增強(qiáng)AIVs與哺乳動(dòng)物SAα2,6-Gal受體的結(jié)合[16-17]，T160A常發(fā)生于感染人的HPAIVs[27]，可增強(qiáng)AIVs在豚鼠和雪貂等哺乳動(dòng)物中的傳播性[17]。除HA之外，分離毒株還存在多個(gè)突變(表2)可能影響病毒致病性和感染宿主特異性等方面的特性，如PB2的L89V[12-13]和PB1-F2的N66S[15]可提高病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制活性和對(duì)小鼠的毒力，NS1的 P42S[20]以及M1的N30D和T215A[18]突變均可增強(qiáng)AIVs在小鼠中的毒力， Env-XJ-1-H5N8 PB1的I368V突變可增強(qiáng)H5亞型AIVs的傳播性[14]，上述突變中的一些也存在于野鳥源H5N8 AIV[28-29]和人感染的HPAI-Vs[30]。

本研究從新疆烏魯木齊市LPM外環(huán)境中分離的2株H5N8 AIVs呈高致病性，其與2016-2017年分離自國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)外環(huán)境中的H5N8 AIVs的遺傳關(guān)系較近，可能隨野鳥遷飛而廣泛傳播，另外，分離毒株多個(gè)基因與2010-2012年華東地區(qū)家鴨中分離的H5N8 AIVs的遺傳距離接近，其多個(gè)突變可增強(qiáng)病毒的致病性和跨物種傳播的能力，有潛在引發(fā)AI疫情和威脅公共衛(wèi)生的風(fēng)險(xiǎn)。