表達(dá)豬δ冠狀病毒S1蛋白植物乳桿菌的構(gòu)建及驗(yàn)證

郝嘉翼，李樂天，張和平，陳永福，金寧一，王茂鵬，李 昌*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林 長春 130122；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325035)

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)又稱為豬丁型冠狀病毒，是近年來新出現(xiàn)的一種可引起仔豬腸道疾病的豬腸道冠狀病毒。該病于2012年首次在中國香港被報(bào)道，2014年，PDCoV疫情在美國的俄亥俄州暴發(fā),隨后在世界多個(gè)國家,如亞洲的中國、日本、韓國、泰國等，北美洲的加拿大、墨西哥等地區(qū)相繼被報(bào)道[1]。PDCoV可感染不同日齡豬，新生仔豬更為易感，其臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)相似，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)死亡，對(duì)于新生仔豬的致死率可達(dá)到30%～40%[2]。此外，PDCoV目前被證明還可以感染犢牛[3]、家禽[4]，并引起家禽腹瀉癥狀[5]。最近發(fā)現(xiàn)，PDCoV利用宿主氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)作為受體，通過S蛋白介導(dǎo)與允許APN同源介導(dǎo)進(jìn)入的種間保守結(jié)構(gòu)域相互作用，從而感染人源細(xì)胞[6]，提示PDCoV具有跨物種傳播的內(nèi)在潛力，是一種潛在的高風(fēng)險(xiǎn)新型冠狀病毒病原體，研發(fā)其疫苗具有重要的公共衛(wèi)生意義。

PDCoV 是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，電鏡下病毒粒子呈球形或橢圓形，其囊膜上有冠狀纖突，整體形狀類似“皇冠”，直徑為 60～180 nm，基因組大約為25.4 kb，在目前已知冠狀病毒中，PDCoV基因組長度最小。PDCoV編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白 (membrane protein，M)、核衣殼蛋白(nuecleocapsid protein，N)。其中，S蛋白是位于PDCoV病毒囊膜表面能夠與宿主細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合使病毒穿入細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抵抗PDCoV的中和抗體[7]。PDCoV S蛋白含有蛋白酶水解位點(diǎn)，蛋白酶可將其水解為N-末端S1結(jié)構(gòu)域和C-末端的S2結(jié)構(gòu)域。S1結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)受體識(shí)別，含有中和抗體表位，特別是S1區(qū)包括受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)，是與APN結(jié)合的主要區(qū)域，具有良好的免疫原性，是研發(fā)PDCoV疫苗的首選區(qū)域[8]。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一類能利用可發(fā)酵的碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌。如果宿主體內(nèi)可以提供充足的乳酸菌，就可以阻止致病菌的定植，并且可以降低膽固醇含量，制造營養(yǎng)物質(zhì)，控制內(nèi)毒素，誘發(fā)腸道黏膜免疫[9]。由此可見，益生乳酸菌與人和動(dòng)物生命活動(dòng)密切相關(guān)。而乳桿菌可以耐受胃酸和膽鹽等極端環(huán)境，具有較強(qiáng)的黏附定植腸道上皮的能力，所以利用乳桿菌作為基因工程菌表達(dá)異源蛋白已經(jīng)得到廣泛驗(yàn)證，如利用植物乳桿菌表達(dá)新型冠狀冠病毒(SARS-CoV-2)RBD蛋白，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量特異性sIgA，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，進(jìn)而提高體液免疫和細(xì)胞免疫[10]；利用干酪乳桿菌表達(dá)PEDV S蛋白和TGEV S蛋白D抗原聯(lián)合的二價(jià)口服疫苗可產(chǎn)生較高的中和抗體[11]。

本試驗(yàn)選用植物乳桿菌LP18表達(dá)含1320信號(hào)肽和DCpep優(yōu)化的PDCoV S1蛋白基因，以乳酸乳球菌NZ3900作為克隆宿主，獲得較高含量的重組質(zhì)粒，最終使PDCoV S1基因在植物乳桿菌LP18中表達(dá)，并建立了有效的制備及鑒定方法，優(yōu)化了蛋白表達(dá)量，為開發(fā)PDCoV口服疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株含1320信號(hào)肽和DCpep優(yōu)化的PDCoV S1基因的質(zhì)粒由南京金斯瑞公司合成并保存；pSIP 411載體、乳酸乳球菌NZ3900、植物乳桿菌LP18由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自蘇州康寧生命科技有限公司；MRS、M17培養(yǎng)基購自海博生物公司；HA Tag Rabbit Polyclonal antibody購自Proteintech公司；羊Anti-Rabbit IgG 購自北京碧云天有限公司；Clone Express Multis One Step Cloning Kit 和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；誘導(dǎo)肽SppIP由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 目的基因的設(shè)計(jì)根據(jù)PDCoV S蛋白氨基酸序列(GenBank：QAA06990.1)，選擇其S1區(qū)域， 在N端插入1320信號(hào)肽，C端插入DCpep短肽，并在其后添加HA-Tag，上下游分別添加XhoⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，密碼子優(yōu)化后交由金斯瑞公司合成。

1.4 引物的設(shè)計(jì)及合成利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物L(fēng)PS1-F和LPS1-R，用于擴(kuò)增PDCoV S1基因序列，片段長度為1 939 bp；通用引物TF01和TR01用于擴(kuò)增pSIP411及其衍生物，長度為2 407 bp。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.5 PDCoV S1基因擴(kuò)增以合成的PDCoV S1質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol/L each)1 μL， LPS1-F、LPS1-R各1 μL，Phanta Max Supper-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min;95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并將產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

1.6 重組乳桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定利用無縫克隆技術(shù)將1.5中的膠回收片段連接到pSIP411載體，然后將其電轉(zhuǎn)化到中間克隆宿主乳酸乳球菌NZ3900。將菌液涂布于含20 mg/L紅霉素的G-M17固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)12 h后挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，待驗(yàn)證無誤后提取質(zhì)粒并測(cè)序。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP18，涂布于含20 mg/L紅霉素的固體MRS培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，用引物TF01和TR01進(jìn)行菌液PCR鑒定。

1.7 重組乳桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取鑒定為陽性的單克隆菌落，按1%接種于新配制的MRS液體培養(yǎng)基(紅霉素含量為20 mg/L)，37℃培養(yǎng)至D值為0.3～0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)肽SppIP(50 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。8 000 r/min離心3 min收菌，用無菌PBS洗重組菌3遍，去除MRS培養(yǎng)基，再用PBS將重組菌重懸，加入等量玻璃珠于研磨機(jī)研磨，收集上清用于下一步蛋白表達(dá)驗(yàn)證。

1.8 外源基因表達(dá)的Western blot鑒定取100 μL上述蛋白，加入25 μL 5×Loading Buffer 充分混勻后沸水中煮7 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE。通過半干法轉(zhuǎn)膜，用于Western blot分析：5%脫脂乳室溫封閉2 h，用PBST配制1∶1 000的兔源Anti-HA抗體在室溫下孵育2 h，PBST洗3次；用1∶5 000 HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗在室溫下孵育40 min，用PBST洗3次后ECL法顯影。

1.9 外源基因表達(dá)的間接免疫熒光檢測(cè)將重組菌按1%接種于含有紅霉素(20 mg/L)的MRS培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)8 h后收菌；用PBS洗3遍，加入兔源Anti-HA抗體(1∶1 000)，孵育過夜；用PBS洗3遍，于FITC標(biāo)記的二抗(1∶5 000)中孵育2 h；PBS洗3遍，在油鏡下觀察。

1.10 外源基因表達(dá)的流式細(xì)胞分析將重組菌誘導(dǎo)8 h，用HA兔源多抗(1∶1 000)孵育過夜，PBS清洗3次，用FITC標(biāo)記二抗(1∶5 000)孵育2 h，PBS洗3次后用于流式細(xì)胞分析。

1.11 重組乳桿菌表達(dá)PDCoV S1蛋白優(yōu)化按1.8所述方法進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化。誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)分別為4，6，8，10，12，16，20，24 h。誘導(dǎo)肽質(zhì)量濃度分別為50，100，150，200 μg/L。誘導(dǎo)溫度分別為33，37，42℃。誘導(dǎo)表達(dá)后，通過Western blot對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的設(shè)計(jì)與合成以PDCoV流行株(GenBank：QAA06990.1)S蛋白為基礎(chǔ)，選取S1結(jié)構(gòu)域(1～530)(圖1A)，同時(shí)，在N端添加1320信號(hào)肽、在C端添加DCpep和HA標(biāo)簽，得到重組序列PDCoV S1(圖1B)。

圖1 PDCoV S1基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 目的基因的擴(kuò)增利用無縫克隆引物，通過PCR從含有PDCoV S1的質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得1條長度為1 939 bp 的特異性條帶，與預(yù)期大小符合(圖2)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為PDCoV S1序列，未發(fā)生突變。

M.DL5000 DNA Marker；1.PDCoV S1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定用無縫克隆技術(shù)將獲得的目的基因片段克隆入植物乳桿菌表達(dá)載體pSIP411，并將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入克隆宿主乳酸乳球菌NZ3900，菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證顯示其序列正確，提取質(zhì)粒，即為構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pSIP411-PDCoV S1(圖3A)。再次將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP18中，進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖3B所示，在2 407 bp有特異性條帶，與預(yù)期相符，測(cè)序進(jìn)一步表明目的基因正確。上述結(jié)果表明已經(jīng)成功將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至植物乳桿菌LP18中，將驗(yàn)證正確的重組乳桿菌命名為LP18：pSIP411-PDCoV S1。

A.pSIP411-PDCoV S1 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖(RepA和RepC.乳酸菌的復(fù)制起點(diǎn)；emL.紅霉素抗性標(biāo)記；sppK，sppR.組氨酸蛋白激酶和相應(yīng)調(diào)控元件；HA.流感病毒血凝素表位短肽序列)；B.重組乳桿菌LP18：pSIP411-PDCoV S1的PCR鑒定結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker；1.植物乳桿菌LP18；2～4.電轉(zhuǎn)后的植物乳桿菌LP18的單克隆菌)

2.4 外源基因表達(dá)的Western blot 鑒定將構(gòu)建正確的重組菌培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)肽SppIP(50 μg/L)，誘導(dǎo)6 h后收集細(xì)菌并提取蛋白，進(jìn)行Western blot 鑒定，以分別加誘導(dǎo)劑和不加誘導(dǎo)劑且含空白質(zhì)粒的LP18作為對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，加入誘導(dǎo)劑的重組乳桿菌LP18：pSIP411-PDCoV S1中可見70 kDa 大小的特異性條帶，與預(yù)期相符，而含有空質(zhì)粒的重組菌，無論誘導(dǎo)與否，都沒有條帶，表明PDCoV S1基因可以在植物乳桿菌LP18中表達(dá)。

M.蛋白Marker；SppIP+.加誘導(dǎo)劑；SppIP-.不加誘導(dǎo)劑

2.5 外源基因表達(dá)的免疫熒光分析通過間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)外源基因的進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，LP18空載體與未加誘導(dǎo)劑的重組菌(LP18：PDCoV S1)未見熒光，而加入誘導(dǎo)劑的重組乳桿菌(LP18:pSIP411- PDCoV S1)的菌體可見熒光，且主要分布于菌體表面。進(jìn)一步證明PDCoV S1基因可在LP18中表達(dá)且表達(dá)的目的蛋白錨定在菌體表面，與設(shè)計(jì)相符。

SppIP+.加誘導(dǎo)劑；SppIP-.不加誘導(dǎo)劑

2.6 外源基因表達(dá)的流式細(xì)胞分析通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LP18：pSIP411-PDCoV S1的陽性率，以含空載體的植物乳桿菌LP18和未加誘導(dǎo)劑的LP18：pSIP411-PDCoV為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖6所示，LP18：pSIP411-PDCoV S1的陽性率為28.62%(圖6)，而另外2種菌未見陽性，表明重組乳桿菌LP18：pSIP411-PDCoV S1具有較高表達(dá)效率。

SppIP+.加誘導(dǎo)劑；SppIP-.不加誘導(dǎo)劑

2.7 重組乳桿菌表達(dá)條件的優(yōu)化分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度以及不同溫度下對(duì)重組菌LP18：pSIP411-PDCoV S1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并提取蛋白，以BCA法定量后，進(jìn)行SDS-PAGE。由圖7可以看出，重組菌在誘導(dǎo)6 h表達(dá)量最高(7A);在誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度為150 μg/L時(shí)，表達(dá)量最高(7B)；重組菌在33℃時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)量最高(7C)。因此，重組菌LP18：pSIP411-PDCoV S1的最優(yōu)表達(dá)條件：溫度33℃，誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度150 μg/L，誘導(dǎo)時(shí)間6 h。

A.不同誘導(dǎo)時(shí)間的蛋白表達(dá)(M.蛋白Marker；4～24 h為不同誘導(dǎo)時(shí)間);B.不同誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(M.蛋白Marker；50，100，150，200 μg/L為不同誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度);C.不同誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(M.蛋白Marker；33，37，42℃為不同誘導(dǎo)溫度)

3 討論

眾所周知，冠狀病毒的出現(xiàn)，給人類和其他動(dòng)物造成了重大威脅，豬腸道冠狀病毒更是給全球畜牧業(yè)帶來了極大損失，因此進(jìn)行冠狀病毒研究與防治工作至關(guān)重要[8]。PDCoV是一種新被發(fā)現(xiàn)的腸道冠狀病毒，不僅可以引起新生仔豬的腹瀉、嘔吐等癥狀，更可以感染禽類、犢牛，是一種高風(fēng)險(xiǎn)的新型冠狀病毒。但目前對(duì)于PDCoV的研究并不多，尚不清楚其傳播和致病機(jī)制，因此研究一種有效的疫苗尤為關(guān)鍵。PDCoV S蛋白能夠辨別靶細(xì)胞，從而促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合，不但能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，同時(shí)還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[12-13]。PDCoV S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域有多個(gè)產(chǎn)生中和抗體的重要表位，是受體識(shí)別、結(jié)合細(xì)胞的關(guān)鍵部位[14]。LU等[15]將純化后的S1蛋白作為包被抗原，檢測(cè)豬血清和乳汁中PDCoV的IgA抗體，ELISA結(jié)果顯示，PDCoV-S1-IgA具有較高的特異性和敏感性，為PDCoV的快速檢測(cè)和疫苗免疫評(píng)估提供重要的依據(jù)。張爽等[16]利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PDCoV-RBD蛋白，通過Western blot、間接免疫熒光方法證明感染rBac-PDR的Sf9細(xì)胞能夠正確表達(dá)PDCoV-RBD蛋白，為后續(xù)PDCoV診斷試劑開發(fā)及亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

乳酸菌遞送載體因其具有獨(dú)特的特性以及潛在的應(yīng)用，受到了廣泛的關(guān)注。乳酸菌作為一種非致病性微生物，具有更高的安全性優(yōu)勢(shì)，其細(xì)胞壁缺乏脂多糖成分，沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。由于多數(shù)乳酸菌具有免疫佐劑的作用，所以異源抗原能夠在乳酸菌中大量表達(dá)因而可促進(jìn)免疫反應(yīng)[17]。研究表明，將乳酸乳球菌表達(dá)百日咳桿菌F1S1融合蛋白的黏膜載體疫苗通過口服和滴鼻接種BALB/c小鼠，結(jié)果表明在小鼠肺內(nèi)容物中檢測(cè)出了較高水平的特異性SIgA，而且可誘導(dǎo)全身黏膜免疫反應(yīng)[18]。DC廣泛分布在胃腸道上皮下，是免疫系統(tǒng)的哨兵[19]。當(dāng)病原體侵襲時(shí)，DC通過捕獲外來抗原來激活幼稚T細(xì)胞，由Th1免疫應(yīng)答向Th2免疫應(yīng)答方向極化。腸道DC亞群可以調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)，因此DC細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[20]。近幾年研究表明，當(dāng)重組乳酸菌所表達(dá)的抗原與樹突細(xì)胞靶肽融合時(shí)，可以更好地提高機(jī)體免疫力。MANSOUR等[21]將其炭疽桿菌保護(hù)抗原(PA)基因與樹突細(xì)胞靶向肽基因DCpep融合，通過嗜酸乳桿菌表達(dá)融合蛋白PA-DCpep，小鼠口服后，產(chǎn)生了大量PA中和抗體，并且刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使小鼠對(duì)炭疽桿菌產(chǎn)生有效的保護(hù)力。MICHON等[22]構(gòu)建了以DC表面受體DEC-205為靶點(diǎn)的植物乳桿菌菌株，增強(qiáng)了植物乳桿菌與DC細(xì)胞的結(jié)合能力，從而改善cDNA向免疫細(xì)胞的遞送能力。本試驗(yàn)選擇DCpep作為樹突細(xì)胞靶向肽，有效地將抗原呈遞給免疫細(xì)胞，增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答，提高免疫原性，更有利于免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。pSIP系統(tǒng)已成功應(yīng)用于植物乳桿菌和清酒乳桿菌中多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、分泌和表面錨定[23-24]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用pSIP系統(tǒng)建立了植物乳桿菌表達(dá)平臺(tái)，進(jìn)行了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)[25]、新型冠狀病毒SARS-CoV2[26]、3型豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)[27]等多種病毒蛋白的表達(dá)與免疫研究。本研究中，利用建立的植物乳桿菌表達(dá)平臺(tái)，進(jìn)行了PDCoV S1的構(gòu)建與表達(dá)，豐富了植物乳桿菌表達(dá)異源蛋白的可能性，也可以更好地提高機(jī)體免疫力。通過表面錨定的方式，可以增加乳酸菌的表達(dá)量，并且能夠有效增加抗原的刺激。對(duì)乳酸菌載體來說，其表達(dá)量較低，所以對(duì)于同源信號(hào)肽的選擇十分重要。1320信號(hào)肽為脂質(zhì)錨定型信號(hào)肽，有較強(qiáng)的表面展示性功能，不僅能夠展示異源蛋白，還具有促進(jìn)異源蛋白表達(dá)的功效。因此，本試驗(yàn)選用1320信號(hào)肽作為異源蛋白的標(biāo)簽確保PDCoV S1蛋白可以在乳酸菌中順利表達(dá)。乳酸菌作為基因工程疫苗具有佐劑的作用，對(duì)于植物乳桿菌來說，密碼子的偏向性是此菌株的特征之一，本研究對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，并優(yōu)化了影響乳酸菌載體表達(dá)的因素，最終得到了1株表達(dá)量較高的重組乳酸菌。

綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建1株能夠穩(wěn)定表達(dá)PDCoV S1蛋白的植物乳桿菌，為PDCoV口服疫苗的開發(fā)提供了依據(jù)。