花期及提取方法對重瓣梔子花成分及活性影響

闕珊奇 楊良緣 胡 鈺 張有做 許光治 王 艷 倪勤學

（浙江農林大學食品與健康學院，浙江 杭州 311300）

食用花卉是世界范圍內豐富的自然資源［1］，隨著人們對食用花卉的認識越來越科學和全面，食用花卉的營養(yǎng)價值和功效逐漸被認可，食用范圍和品種也愈發(fā)廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，食用花卉中富含糖類、氨基酸、礦物質、多酚、黃酮、花青素等多種營養(yǎng)活性成分［2-3］，具有抗氧化［4］、抗炎［5］、抗癌、保護臟器、基因保護及神經保護等作用［6］。深入研究可食用花卉的營養(yǎng)價值、活性成分、功效作用等，有利于食用花卉在營養(yǎng)功能食品和天然抗氧化劑領域的開發(fā)利用［7］。

重瓣梔子花［Gardenia jasminoidesEllis var.fortuniana（Lindl.）Hara］又稱白蟾、玉荷花等［8］，作為茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia）植物的花朵，其花朵大且為重瓣，多用于庭院觀賞，主產于我國中部及中南部地區(qū)，在越南與日本也有種植。梔子花中含有糖類、維生素、微量元素、氨基酸等營養(yǎng)成分［9］及環(huán)烯醚萜類、酚類、黃酮類、有機酸酯類等活性物質［10-11］。陳犇等［12］發(fā)現(xiàn)梔子花酵素液中的總糖和總酸含量較高；Zhang 等［13］從野生梔子花中分離得到環(huán)烯醚萜類、酚類、黃酮類等21種化合物，其主要成分具有抗壓降脂、抑菌抗炎的藥理作用；徐曉俞等［14］發(fā)現(xiàn)梔子花細胞液含有較多的醇類、萜烯類、酮類、酚類等抗焦慮、抗菌、抗炎成分。目前，大量科學研究集中于梔子屬植物的化學成分、藥理活性、相關作用機制和安全性等方面，研究對象多為梔子果實，少有研究關注梔子花成分及功能活性，對梔子花的開發(fā)利用仍處于探索階段。為進一步開發(fā)梔子花卉資源，本試驗研究不同花期和不同提取方式對重瓣梔子花營養(yǎng)、活性成分含量及抗氧化活性等的影響，探究其最佳采摘期及提取方式，旨在為食用梔子花卉的栽培及開發(fā)提供參考，并為綜合利用梔子花卉資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 重瓣梔子花采摘于浙江農林大學平山試驗基地，根據花瓣盛開情況分為3 類：花蕾期（微露外層白色花瓣）、盛開期（完全露出白色花瓣）、衰敗期（露出褐色花瓣且萎蔫），如圖1所示。新鮮重瓣梔子花采摘除雜后，于-80 ℃冷凍3 d 后進行冷凍干燥，制備成凍干花，粉碎備用。

圖1 不同花期重瓣梔子花Fig 1 Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.）Hara at different florescence

1.1.2 試劑 蘆丁、梔子苷、福林酚，上海源葉生物科技有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪［2，4，6-tris（3-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ］，北京百靈威試劑有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶，德國Sigma 公司；葡萄糖、沒食子酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2＇-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2＇-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS］、阿波卡糖、考馬斯亮藍、牛血清蛋白，阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙醇、石油醚、濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）、苯酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀、氯化鐵、抗壞血酸，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-2510 DTH 超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司；YB-1000 A高速多功能粉碎機，金華永康速鋒工貿有限公司；UV-5500紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；TGL-20B-C 高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；SHB-Ⅲ-A 循環(huán)水式多用真空泵，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；RE-52 A旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BSA 224 S 分析天平，上海人和科學儀器有限公司；DGG-9123 AD 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信試驗儀器有限公司；DK-S 24 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；Freezone? 18 L立式凍干機，美國Labconco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 重瓣梔子花提取物的制備

1.3.1 .1 乙醇提取物的制備 取重瓣梔子干花10 g，以1∶20 的料液比加入200 mL 無水乙醇，30 ℃超聲30 min后將料液進行抽濾，重復操作2次，合并濾液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷凍3 d后進行冷凍干燥，稱重備用。

1.3.1 .2 水浸提物的制備 取重瓣梔子干花10 g，以1∶20的料液比加入200 mL蒸餾水，30 ℃超聲30 min后將料液進行抽濾，重復操作2 次，合并濾液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷凍3 d后進行冷凍干燥，稱重備用。

1.3.1 .3 石油醚提取物的制備 取重瓣梔子干花10 g，以1∶20的料液比加入200 mL石油醚，30 ℃超聲30 min后將料液進行抽濾，重復操作2 次，合并濾液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷凍3 d后進行冷凍干燥，稱重備用。

1.3.1 .4 水蒸氣蒸餾物的制備 取重瓣梔子花鮮花1 kg 于蒸餾鍋中，以1∶6 的料液比加入6 000 mL 蒸餾水進行蒸餾，取蒸餾液靜置分層，收集上層液，加無水硫酸鈉脫水12 h后過濾，得到蒸餾產物，稱重備用。

按照公式計算梔子花提取物得率：

1.3.2 水分含量測定 根據《GB 5009.3-2016 食品安全國家標準 食品中水分的測定》［15］，采用直接干燥法測定水分含量。

1.3.3 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，根據徐亞等［16］的方法并稍作調整。以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：Y=4.318 4X+0.001（R2=0.994 8，n=6），結果以每克干基中牛蛋白血清當量表示。

1.3.4 脂類含量測定 根據《GB 5009.6-2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》［17］，采用索氏抽提法測定脂類含量。

1.3.5 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，根據Rover等［18］的方法并略作調整。以葡萄糖為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：Y=12.814 0X-0.014（R2=0.995 0，n=6），結果以每克干基中葡萄糖當量表示。

1.3.6 總酚含量測定 根據張露等［19］的方法，采用Folin-Ciocalteu 比色法測定總酚含量。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：Y=0.073 7X+0.004（R2=0.998 6，n=5），結果以每克干基中沒食子酸當量表示。

1.3.7 總黃酮含量測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色法測定總黃酮含量，根據孫曉波等［20］的方法并稍作調整。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：Y=5.065 7X+0.003（R2=0.996 8，n=5），結果以每克干基中蘆丁當量表示。

1.3.8 總環(huán)烯醚萜類含量測定 根據周婷婷等［21］的方法，以梔子苷為標準品繪制標準曲線，得曲線方程為：Y=0.028 1X-0.005 3（R2=0.998，n=7），結果以每克干基中梔子苷當量表示。

1.3.9 DPPH 自由基清除能力測定 根據Zhang等［22］的方法并稍作調整，以無水乙醇為空白對照，抗壞血酸（Vitamin C，Vc）為陽性對照。樣品提取液對DPPH 自由基清除能力以清除率達到50%時所需要的樣品質量濃度（IC50，μg·mL-1）表示。計算公式如下：

式中，A0為2 mL DPPH 溶液和2 mL 乙醇溶液的吸光度；A1為2 mL DPPH 溶液和2 mL 樣品溶液的吸光度；A2為2 mL乙醇溶液和2 mL樣品溶液的吸光度。

1.3.10 ABTS自由基清除能力測定 參考Taneva等［23］的方法并稍作調整，以無水乙醇為空白對照，抗壞血酸（Vc）為陽性對照，樣品提取液對ABTS 自由基清除能力以IC50表示。計算公式如下：

式中，As為3.9 mL ABTS 工作液和0.1 mL 乙醇溶液的吸光度；An為3.9 mL ABTS 工作液和0.1 mL 樣品溶液的吸光度；Am為3.9 mL 乙醇溶液和0.1 mL 樣品溶液的吸光度。

1.3.11 總抗氧化能力FRAP 值測定 參考Dong等［24］的方法，得到標準曲線為Y=0.637 5X+0.034 4（R2=0.991 1，n=7）。取重瓣梔子花樣品0.4 mL，鐵離子還原抗氧化能力（ferricion reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）工作液3 mL，混勻后37 ℃水浴加熱10 min，于593 nm處檢測吸光度。

1.3.12 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 根據Barik等［25］的方法并略作調整，用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）將樣品稀釋成適宜濃度梯度，以阿卡波糖作為陽性對照，在405 nm處測定其吸光值，并計算IC50。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式如下：

式中，Aa為酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）工作液、底物的吸光度；Ab為PBS 工作液和底物的吸光度；Ac為酶、樣品、底物、PBS 工作液的吸光度；Ad為PBS工作液、樣品、底物的吸光度。

1.3.13 抑菌活性的測定

1.3.13 .1 菌種活化 配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌加入到液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，放置于37 ℃的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，分別將酵母菌、根霉菌加入固體培養(yǎng)基中進行劃線活化培養(yǎng)，放置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.13 .2 抑菌圈試驗 采用牛津杯法［26］測定重瓣梔子花的抑菌能力。在營養(yǎng)瓊脂平板上打入100 μL菌懸液，均勻涂布在培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基上呈“品”字型放置3 個滅菌后的干燥牛津杯（內徑6 mm，外徑8 mm）。吸取各樣品溶液50 μL加入牛津杯中，將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（大腸桿菌與枯草芽孢桿菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h，酵母菌與根霉菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h）。以蒸餾水為陰性對照，平行3次試驗，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據處理

各處理3次重復，結果以Xˉ± S表示，用SPSS 22及Excel 2010 進行數(shù)據統(tǒng)計分析，用Origin 2021 軟件繪圖，Adobe Photoshop 2020 進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 不同花期重瓣梔子花的營養(yǎng)成分分析

由表1 可知，盛開期和衰敗期重瓣梔子花的含水率有顯著差異，盛開期比衰敗期高1.81%；脂類和蛋白質含量的范圍分別為1.15%～1.37%和0.61%～0.67%，不同花期間無顯著差異?；ɡ倨诤褪㈤_期重瓣梔子花的糖類含量均顯著高于衰敗期，分別是衰敗期的1.26和1.22倍。表明重瓣梔子花在生長過程中4種營養(yǎng)成分的含量會有一定的變化，但總體變化較小，其中盛開期的重瓣梔子花營養(yǎng)品質較好。

表1 不同花期重瓣梔子花的營養(yǎng)成分含量Table 1 Nutrient content of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence/%

2.2 不同花期重瓣梔子花的活性成分分析

酚類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類是梔子花中重要的活性物質，不同花期的重瓣梔子花中3 種生物活性成分的含量見圖2。結果表明，3 個花期的重瓣梔子花中總酚、總黃酮及總環(huán)烯醚萜含量均具有顯著差異，總酚、總黃酮和總環(huán)烯醚萜含量分別為0.77%～1.58%、0.68%～4.36%和8.85%～10.91%。其中，盛開期重瓣梔子花的總酚、總黃酮和總環(huán)烯醚萜含量分別達到1.58%、4.36%和10.91%，均顯著高于花蕾期和衰敗期。表明重瓣梔子花在生長過程中活性成分的含量變化較大，其中盛開期的重瓣梔子花活性成分含量較高。

圖2 不同花期重瓣梔子花活性成分含量Fig.2 Active ingredient content of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence

2.3 不同花期重瓣梔子花的抗氧化活性分析

重瓣梔子花中抗氧化物質對自由基的清除能力以及對金屬離子的還原能力是檢測其體外抗氧化活性的有效方法。DPPH 自由基清除率達到50%時所需的樣品質量濃度越低，則清除效果越好。由表2可知，盛開期重瓣梔子花DPPH IC50為110.83 μg·mL-1，清除能力顯著高于花蕾期和衰敗期。同時，3 個花期重瓣梔子花的ABTS 自由基清除能力有顯著差異，清除能力表現(xiàn)為盛開期＞花蕾期＞衰敗期。盛開期的FRAP 值為0.710 mmol·g-1，略高于花蕾期和衰敗期，無顯著差異。表明不同花期重瓣梔子花均具有抗氧化活性，盛開期重瓣梔子花DPPH、ABTS自由基清除能力、FRAP鐵離子還原能力均大于花蕾期和衰敗期，有一定的抗氧化活性。

表2 不同花期重瓣梔子花的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence

2.4 不同提取方法對重瓣梔子花的活性成分影響

不同花期重瓣梔子花的營養(yǎng)成分、活性成分及抗氧化活性測定結果顯示，盛開期重瓣梔子花的品質較好，因此選擇盛開期的重瓣梔子花為材料，通過不同的提取方法得到重瓣梔子花提取物，并測定其活性成分，結果如圖3所示。不同提取方法的重瓣梔子花提取得率有顯著差異，乙醇提取物和水提取物的得率分別為30.53%和45.73%，分別是石油醚提取物的13.45 和20.14 倍，而水蒸氣蒸餾物的得率極低，僅為0.03%。

圖3 不同提取方法對重瓣梔子花得率及活性成分含量影響Fig.3 Effects of the yield and content of active components of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara by different extraction methods

在總糖含量上，乙醇提取物和水提取物顯著高于石油醚提取物和水蒸氣蒸餾物，分別達到44.04%和53.53%，是石油醚提取物的6.23和7.81倍，水蒸氣蒸餾物的7.88 和9.58 倍。各提取物之間的總酚含量也存在顯著差異，乙醇提取物的總酚含量是水提取物的2.77 倍、石油醚提取物的2.47 倍、水蒸氣蒸餾物的4.13 倍?？傸S酮含量同樣表現(xiàn)為乙醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物＞水蒸氣蒸餾物，各提取物之間含量差異顯著，其中乙醇提取物的總黃酮含量最高，為8.40%。在不同提取方法中，除了石油醚提取物中未能檢測到總環(huán)醚萜類物質外，其余各提取物之間差異顯著，乙醇提取物總環(huán)烯醚萜含量最高，為19.80%。上述結果表明，乙醇和水作為提取溶劑，提取物的得率和總糖含量較高，且乙醇提取物中總酚、總黃酮、總環(huán)烯醚萜含量顯著高于其他3 種溶劑，更有利于保留重瓣梔子花的活性成分。

2.5 不同提取方法對重瓣梔子花抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

由表3 可知，不同提取方法得到的重瓣梔子花提取物對DPPH 自由基都有一定的清除能力。其中乙醇提取物的清除能力顯著高于其他提取物，IC50值為98.50 μg·mL-1。重瓣梔子花乙醇提取物和水提取物的ABTS 自由基清除能力較強，顯著高于其他提取物，IC50值分別為65.79 和76.16 μg·mL-1。FRAP 鐵離子還原能力表現(xiàn)為水蒸氣提取物＞乙醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物，可見水蒸氣蒸餾物和乙醇提取物有較好的鐵離子還原能力。重瓣梔子花乙醇提取物的α-葡萄糖苷酶IC50值為275.48 μg·mL-1，而石油醚提取物、水提取物和水蒸氣蒸餾物未表現(xiàn)出α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表3 不同提取物方法對重瓣梔子花的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性影響Table 3 Effect of different extract methods on antioxidant activity and α- glucosidase inhibitory activity of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara

綜上，相較于其他提取物，重瓣梔子花乙醇提取物具有更全面且良好的抗氧化能力及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，水提取物具有較好的DPPH、ABTS 自由基清除能力，而水蒸氣蒸餾物具有較好的鐵離子還原能力。

2.6 不同提取方法對重瓣梔子花抑菌能力的影響

根據抗微生物藥物敏感性的判定標準，抑菌圈直徑大于20 mm 為極敏感，15～20 mm 為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，小于10 mm為低度敏感［27］。通過對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌的抑菌試驗，檢測重瓣梔子花不同提取方法的抑菌效果。由表4可知，重瓣梔子花不同提取方法對不同菌種的抑菌效果存在差異，其中大腸桿菌對重瓣梔子花水蒸氣蒸餾物（11.37 mm）和石油醚提取物（10.23 mm）中度敏感，枯草芽孢桿菌對水提取物（10.18 mm）、石油醚提取物（10.47 mm）和水蒸氣蒸餾物（10.33 mm）中度敏感；四種提取物均未表現(xiàn)出對根霉菌的抑制作用。抑菌圈的直徑可以直接表現(xiàn)出試驗組分的抑菌能力，直徑越大，抑菌效果越強。由此可知，在同等濃度條件下，重瓣梔子花水蒸氣蒸餾物的抑菌效果較強，其對大腸桿菌的抑制作用最明顯。

表4 不同提取方法對重瓣梔子花抑菌圈的影響Table 4 Effect of the bacteriostatic circle of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara with different extraction methods/mm

3 討論

目前，梔子果不同提取方法的制備工藝及其活性研究相對成熟［28-29］，而有關梔子花提取物制備［30］及活性影響［31］的研究較少，特別是針對梔子花中營養(yǎng)成分的研究更鮮見報道。本研究利用重瓣梔子花測定不同生長期糖類、蛋白質、脂類、水分含量及其變化，可為梔子花在營養(yǎng)食品方面的開發(fā)利用提供參考。

黃酮類物質可有效清除自由基，減弱自由基對機體的損害［32］。多酚通過螯合金屬離子或作為供氫的自由基清除劑抑制氧化活性，同時對提高DPPH、ABTS自由基清除率具有協(xié)同作用［33］。本研究中，盛開期重瓣梔子花相較于花蕾期和衰敗期的DPPH、ABTS 自由基清除能力更強，其總酚、總黃酮含量也顯著高于花蕾期和衰敗期，由此推測重瓣梔子花中總酚和總黃酮是影響其抗氧化能力的重要因素。這與Pang 等［34］和Reddy 等［35］的結論一致，即酚類、黃酮類化合物含量與抗氧化潛能之間存在很強的正相關關系。為進一步驗證此結論，后續(xù)可對梔子花中黃酮類、酚類物質進行分離鑒定，并對其生理活性開展研究。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效控制α-葡萄糖苷酶活性，是降低II 型糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生率的有效方法［36］。目前II 型糖尿病的治療中最常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物存在較大毒副作用［37］，因此從植物天然產物中尋找安全低毒的治療藥物具有巨大的前景［38］。楊前東［39］發(fā)現(xiàn)提取的梔子花化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，認為梔子花中乙酸、甲酸和黃酮類可能是發(fā)揮降糖作用的主要成分。本研究中，重瓣梔子花乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，IC50值為275.48 μg·mL-1；且僅在乙醇提取物中檢測到抑制作用，這可能與其含有較多酚類、黃酮類極性較小的活性成分有關［40-41］。后續(xù)應深入開展梔子花提取物化學成分研究，并進行體內藥效學驗證，以期從中發(fā)現(xiàn)高效、新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

通過水蒸氣蒸餾或溶劑萃取等方法從植物體內獲得的揮發(fā)性物質具有抗菌作用［42］。本研究發(fā)現(xiàn)，重瓣梔子花提取物對細菌的抑制能力強于對真菌的抑制能力，其中重瓣梔子花水蒸氣蒸餾物對微生物的敏感度更高，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的抑制效果較好。水蒸氣蒸餾物中富含揮發(fā)性物質，這可能是其相較于其他提取物抑菌效果更好的原因。后續(xù)需進一步研究重瓣梔子花不同提取物中的具體成分以及不同濃度的提取物對微生物抑制能力的影響。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)花期和提取方法對重瓣梔子花的成分和活性均有影響。其中盛開期重瓣梔子花活性成分及抗氧化活性最好；重瓣梔子花乙醇提取物的活性成分含量、自由基清除能力以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力均顯著優(yōu)于其他提取物；水蒸氣蒸餾物的抑菌效果最佳，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌較敏感。