GC-MS-AMDIS結(jié)合保留指數(shù)在玫瑰花露香氣成分準(zhǔn)確定性分析中的應(yīng)用

雷春妮，王 波，孫苗苗，代 路

(蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010)

氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定性主要依賴譜庫匹配。由于低分辨質(zhì)譜中的雜質(zhì)、噪聲與共流出物的影響，對目標(biāo)物定性時會出現(xiàn)同一質(zhì)譜圖具有多個高匹配度的化合物與之對應(yīng)，或出現(xiàn)匹配度相近、匹配度極低等現(xiàn)象，使目標(biāo)物準(zhǔn)確定性困難，甚至?xí)?dǎo)致定性錯誤[1-2]。自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(automated mass spectral deconvolution and identification system, AMDIS)能夠?qū)傠x子流圖進行自動解卷積處理，推測共流出離子碎片的歸屬，可提取未知組分更“純凈”的質(zhì)譜圖，對低濃度物質(zhì)的峰、背景較復(fù)雜的峰和重疊峰有較強的分辨解析能力，使定性結(jié)果更準(zhǔn)確[3]。目前，AMDIS法已被用于山茱萸、阿膠等天然產(chǎn)物揮發(fā)性化合物的定性分析[4-7]。

玫瑰花可用來提取玫瑰精油，為了綜合利用玫瑰花資源，提高玫瑰花的附加值，近年來出現(xiàn)了玫瑰花水和玫瑰鮮花細胞液等產(chǎn)品。玫瑰花水是玫瑰精油在蒸餾萃取過程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)品，含有微量的玫瑰精油成分，適量的玫瑰花水具有抗衰老的功效；玫瑰鮮花細胞液是玫瑰鮮花細胞中的揮發(fā)性物質(zhì)在低溫條件下冷凝而成的液體，具有玫瑰鮮花的自然花香。本研究將玫瑰花水和玫瑰鮮花細胞液均稱為“玫瑰花露”。目前，國內(nèi)外沒有玫瑰花露相關(guān)的加工工藝標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品的行業(yè)和國家標(biāo)準(zhǔn)，玫瑰花露生產(chǎn)工藝不盡合理，使玫瑰花露產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。關(guān)于玫瑰產(chǎn)品的研究主要集中在玫瑰精油方面[8-10]，尚未見到對玫瑰花水和玫瑰鮮花細胞液香氣成分差異的研究報道。

本研究擬采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分析玫瑰花露的香氣成分，利用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)結(jié)合NIST14譜庫檢索和保留指數(shù)，對檢測到的香氣成分進行定性鑒別，以期為天然產(chǎn)物香氣成分的分析研究提供方法借鑒，為玫瑰花露香氣品質(zhì)評價提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 裝置與材料

Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate固相萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；磁力攪拌儀：美國TALBOYS公司產(chǎn)品；NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫、AMDIS Version 2.72：美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所產(chǎn)品。

玫瑰花露樣品：甘肅皓思玫瑰制品有限公司產(chǎn)品；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C7～C40)：美國O2si公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1頂空固相微萃取 取10.0 mL玫瑰花露試樣于40 mL頂空瓶，加入磁力攪拌子和1.0 g氯化鈉，封蓋搖勻，置于磁力攪拌儀上加熱(溫度40 ℃，速度1 500 r/min)，40 ℃平衡20 min，將已活化好的萃取頭插入頂空瓶中，在40 ℃下萃取40 min，萃取完成后，將萃取頭于氣相色譜-質(zhì)譜儀解吸7 min。

1.2.2氣相色譜條件 HP-INNOWAX色譜柱(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至180 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；進樣口溫度250 ℃；分流比為10∶1。

1.2.3質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源；電子能量70 eV；MS傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；全掃描模式采樣；質(zhì)量掃描范圍m/z25～500。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

以苦水玫瑰花水為研究對象，比較不同固相萃取頭、樣品量、磁力攪拌方式、氯化鈉含量、萃取溫度、平衡時間、萃取時間對玫瑰花露香氣組分萃取效果的影響。峰面積表示萃取香氣組分的含量，出峰數(shù)表示萃取香氣組分的種類[11]，所以選擇總峰面積和峰數(shù)目2個指標(biāo)考察各因素的萃取效果，優(yōu)化HS-SPME法萃取玫瑰花露揮發(fā)性成分的條件。

2.1.1固相萃取頭的優(yōu)選 固相微萃取的萃取效果在很大程度上取決于目標(biāo)物在樣品和纖維頭涂層材料之間的分配系數(shù)，不同纖維涂層對揮發(fā)性成分吸附能力有所差別。本實驗考察了7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate等7種萃取頭對玫瑰花水香氣組分的萃取效率，示于圖1。結(jié)果表明，7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB萃取頭總峰面積明顯低于其他4種萃取頭，75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate萃取頭總峰面積基本相當(dāng)，而50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭總峰面積略高；75 μm Carboxen/PDMS萃取頭總峰數(shù)明顯高于其他6種萃取頭。此外，75 μm Carboxen/PDMS萃取頭在40 min之前的出峰個數(shù)高于50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，表明75 μm Carboxen/PDMS萃取頭對玫瑰花水輕組分香氣成分富集效果較好。綜合考慮，選擇75 μm Carboxen/PDMS萃取頭。

圖1 不同固相萃取頭的優(yōu)選Fig.1 Optimization of different solid phase extraction heads

2.1.2樣品量優(yōu)選 樣品量太少會導(dǎo)致吸附目標(biāo)物的量少，樣品量過大則會導(dǎo)致頂空體積變小，影響吸附效果。本實驗考察了5、10、15、20、25 mL不同樣品體積對玫瑰花水香氣成分萃取效果的影響，示于圖2。樣品體積為10 mL時，總峰面積和總峰數(shù)均達到最大值，之后隨著樣品體積增大，總峰面積和總峰數(shù)呈減小的趨勢。這可能是由于樣品量過大，頂空體積變小，影響吸附效果，也可能是由于樣品量過大使萃取頭飽和，不利于萃取。所以，選擇10 mL為樣品最優(yōu)體積。

圖2 不同樣品量的優(yōu)選Fig.2 Optimization of different sample amounts

2.1.3磁力攪拌優(yōu)選 本實驗考察了磁力攪拌對玫瑰花水揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響，示于圖3。經(jīng)過磁力攪拌后的玫瑰花水香氣成分的總峰面積比未攪拌的大，但是相對含量較高的化合物峰面積變化不大。這表明在玫瑰花水中，某些低含量或者低揮發(fā)性的成分可以通過磁力攪拌促進揮發(fā)，進而被萃取頭吸附。因此，實驗選擇磁力攪拌的方式。

圖3 攪拌方式的優(yōu)選Fig.3 Optimization of stirring modes

2.1.4氯化鈉含量優(yōu)選 NaCl作為一種電解質(zhì)，可以促進一些待測物質(zhì)揮發(fā)，提高萃取頭對香氣成分的萃取效率。本實驗考察了0、1.0、2.0、3.0 g NaCl含量對玫瑰花水香氣成分萃取效果的影響，示于圖4。當(dāng)NaCl含量為1.0 g時，總峰面積和總峰數(shù)均達到最大值，之后則均呈下降趨勢。這可能由于NaCl作為一種無機鹽易溶于水相，而玫瑰花水殘留少量玫瑰精油，隨著 NaCl含量的增加，油相限制了NaCl對玫瑰花水香氣物質(zhì)的萃取，因此添加1.0 g NaCl為宜。

圖4 不同氯化鈉含量的優(yōu)選Fig.4 Optimization of different sodium chloride contents

2.1.5平衡時間優(yōu)選 平衡時間即加熱時間，是樣品中的香氣成分在氣相中達到平衡所需要的時間。隨著平衡時間的延長，香氣成分的總峰面積呈下降趨勢，當(dāng)平衡時間為 10 min 時，總峰面積就已達到較大值，示于圖5。香氣成分的總峰數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)平衡時間為20 min 時，總峰數(shù)達到較大值，表明此時已經(jīng)基本達到平衡狀態(tài)。綜合考慮，選擇平衡時間20 min為最優(yōu)。

圖5 不同平衡時間的優(yōu)選Fig.5 Optimization of different balance time

2.1.6萃取溫度優(yōu)選 萃取效果受萃取溫度影響明顯，溫度過低，可能導(dǎo)致樣品中某些組分無法揮發(fā)出來，造成揮發(fā)不完全；溫度過高，可能造成揮發(fā)性成分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致分析結(jié)果失真[12]。本實驗考察室溫、30、40、50、60、70 ℃萃取溫度對峰面積的影響，示于圖6。隨著萃取溫度的升高，總峰面積和總峰數(shù)呈先增大后減小的趨勢，在40 ℃時達到最大值，分別為1.58×1010和272個。這可能是由于溫度升高后加快了分子運動速率，使目標(biāo)物更易被富集吸附，導(dǎo)致出現(xiàn)總峰面積和總峰數(shù)都增大的現(xiàn)象，但溫度過高，低沸點組分在競爭吸附中處于劣勢，造成部分流失[11]。因此，選擇40 ℃為較優(yōu)萃取溫度。

圖6 不同萃取溫度的優(yōu)選Fig.6 Optimization of different extraction temperatures

2.1.7萃取時間優(yōu)選 萃取時間可以影響頂空和萃取頭纖維涂層之間分析物的平衡，當(dāng)萃取時間不足時，香氣組分吸附不充分；萃取時間過長時，已被吸附的組分可能出現(xiàn)脫附現(xiàn)象，造成峰數(shù)減少[13]。本實驗考察20、30、40、50、60 min萃取時間對峰面積的影響，示于圖7。隨著萃取時間的延長，揮發(fā)性成分的總峰面積和峰數(shù)目不斷增大，當(dāng)萃取時間超過40 min時，變化不明顯。考慮到萃取效率，選擇40 min 萃取時間為最優(yōu)。

圖7 不同萃取時間的優(yōu)選Fig.7 Optimization of different extraction time

2.2 玫瑰花露香氣組分分析

富集玫瑰花露香氣獲得的總離子流圖示于圖8。采用 AMDIS對色譜峰純化，通過譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)輔助定性，面積歸一化法相對定量，結(jié)果列于表1。

表1 玫瑰花露香氣成分的鑒定結(jié)果及相對含量Table 1 Identification results and relative contents of aroma components in rose water

圖8 玫瑰花水(a)和玫瑰細胞液(b)的總離子流圖Fig.8 Total ion current chromatograms of rose water (a) and rose cell fluid (b)

玫瑰花水和玫瑰細胞液中共鑒定出60種香氣組分，其中玫瑰花水鑒定出59種香氣成分，相對含量較高的有香茅醇、甲基丁香酚、丁香酚、α-松油醇、芳樟醇等；玫瑰細胞液鑒定出22種香氣成分，相對含量較高的有香茅醇、苯甲醇、甲基丁香酚、α-松油醇、(E)-氧化芳樟醇、芳樟醇等。

續(xù)表1

續(xù)表1

由表1可以看出，2種玫瑰花露的香氣成分在種類和含量上均存在差異，共有成分包括香茅醇、橙花醇、苯甲醇、苯乙醇、甲基丁香酚等21種，在玫瑰花水和玫瑰細胞液中相對含量之和分別為76.60%、78.42%；玫瑰花水特有成分有乙醇、2-乙烯基-2,6,6-三甲基四氫-2H-吡喃、2-庚酮等38種，相對總含量為15.26%；玫瑰細胞液特有成分只有苯甲醛，相對含量為0.60%。

玫瑰花水和玫瑰細胞液中醇類化合物相對含量較高，共鑒定出26種，醇類化合物是玫瑰的主體香氣成分，其含量決定了玫瑰花露的品質(zhì)。玫瑰花水特有7種酮類和7種酯類物質(zhì)，相對含量之和分別為2.21%和2.45%；玫瑰細胞液特有1種醛類物質(zhì)，相對含量為0.6%。玫瑰花露中醚類物質(zhì)差異顯著，共鑒定出7種，玫瑰花水中醚類物質(zhì)含量明顯高于玫瑰細胞液，其中玫瑰花水特有成分有芐甲醚、橙花醚、愈創(chuàng)木酚。此外，萜烯類化合物也是玫瑰花露香氣的重要組成成分，是玫瑰頭香的必要組成部分，共鑒定出5種，其中(E)-B-羅勒烯、萜品油烯、δ-欖香烯是玫瑰花水特有成分。除了上述物質(zhì)外，還鑒定出7種其他類化合物，在玫瑰花水和玫瑰細胞液中的相對含量分別為4.93%和1.47%，其中2-乙?；秽?、2-乙烯基-2,6,6-三甲基四氫-2H-吡喃、3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯是玫瑰花水特有成分，現(xiàn)有文獻對這類物質(zhì)的來源鮮有報道，故需進一步研究確定。

2.3 質(zhì)譜解析方法對玫瑰花露香氣組分鑒定的影響

2.3.1自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)的應(yīng)用 重疊峰是常見的解析難點，用單一譜庫難以定性。AMDIS基于模型峰的邏輯和算法，把峰形模式完全相同的碎片峰提取出來重新組合，構(gòu)建相對純凈的質(zhì)譜圖，可實現(xiàn)對化合物的準(zhǔn)確定性[14]。AMDIS處理圖譜后，對重疊峰進行拆分提取，可提高其解析能力，對化合物進行更加準(zhǔn)確地定性分析。保留時間為25.199 9 min的峰示于圖9，在AMDIS未提取前用NIST14譜庫檢索時，按匹配度排序第一的是庚酸甲酯(正/反匹配度為793/773)，排序第二的是萜品油烯(正/反匹配度為729/746)，匹配度均較低，無法鑒別；經(jīng)AMDIS對TIC圖進行拆分提取處理，該峰為內(nèi)嵌峰，自動拆為2個峰后分別用NIST14譜庫自動檢索，將保留時間25.199 9 min的峰鑒定為庚酸甲酯(匹配度為94.6)，保留時間25.161 7 min的峰鑒定為萜品油烯(匹配度為91.5)。保留時間22.670 0 min的峰示于圖10，用NIST14譜庫檢索時，排序第一的是2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氫呋喃(正/反匹配度為850/817)，排序第四的是1-戊醇(正/反匹配度為756/783)，按譜庫匹配度定性，該峰鑒定結(jié)果應(yīng)為2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氫呋喃；TIC圖經(jīng)AMDIS處理，該峰拆為2個峰，檢索結(jié)果為保留時間22.669 5 min的峰是2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氫呋喃(匹配度為92.2)，保留時間22.727 7 min的峰是1-戊醇(匹配度為91.0)。保留時間40.990 0 min的峰示于圖11，在NIST14譜庫檢索時，排序前四的均是芳樟醇(正/反匹配度為932/934)，結(jié)合文獻[15]報道，芳樟醇是玫瑰花露的香氣成分，該峰往往會定性為芳樟醇，但經(jīng)AMDIS提取，該峰是內(nèi)嵌峰，保留時間40.990 3 min的峰是芳樟醇(匹配度為98.3)，保留時間41.007 5 min的峰是苯甲醛(匹配度為93.7)，其中苯甲醛具有抗菌作用[16]。該方法為玫瑰花露產(chǎn)品功效開發(fā)提供了新思路。

圖9 保留時間25.199 9 min的峰Fig.9 Peak of retention time 25.199 9 min

圖10 保留時間22.670 0 min的峰Fig.10 Peak of retention time 22.670 0 min

圖11 保留時間40.990 0 min的峰Fig.11 Peak of retention time 40.990 0 min

利用NIST譜庫對微量化合物進行檢索時會出現(xiàn)匹配度較低的情況，無法鑒定未知物。如保留時間為55.960 1 min的峰，在玫瑰花水和玫瑰細胞液中的相對含量分別為0.57%、0.30%，含量均較低。其TIC圖未經(jīng)AMDIS提取時，化合物匹配度最高為723/708，且未檢索出橙花醇(CAS：106-25-2)；經(jīng)AMDIS提取后，保留時間55.960 1 min的峰可鑒定為橙花醇(匹配度95.8)。另外，用NIST14譜庫檢索保留時間46.711 5、48.088 0 min的峰時，也出現(xiàn)匹配度較低的情況，TIC圖經(jīng)AMDIS提取后，保留時間46.711 5 min的峰鑒定為苯甲酸甲酯(匹配度為92.1)，在玫瑰花水中的相對含量為0.12%；保留時間48.088 0 min的峰鑒定為乙酸香茅酯(匹配度為96.0)，在玫瑰花水中的相對含量為0.42%。

2.3.2保留指數(shù)的應(yīng)用 為了提高定性的準(zhǔn)確性，結(jié)合保留指數(shù)進一步鑒別化合物。保留指數(shù)表示物質(zhì)在固定液上的保留值行為，具有重現(xiàn)性好、溫度系數(shù)小及標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點，是國際上常用的定性方法，該方法廣泛應(yīng)用于食品、香精香料、中藥、煙草等分析中[17-20]。保留指數(shù)計算公式為：RI=100n+100[t-tn]/[t(n+1)-tn]，式中，RI為保留指數(shù)；n和n+1 分別為目標(biāo)物出峰前后正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；tn和tn+1分別為相應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時間；t為未知物在譜圖中的保留時間(tn

在定性過程中，易出現(xiàn)多個高匹配度的化合物或匹配度較低的現(xiàn)象，此時僅通過譜庫檢索的方法難以準(zhǔn)確定性目標(biāo)化合物。如保留時間為 31.100 2 min的峰，經(jīng)NIST14 質(zhì)譜庫檢索，匹配出3-己烯醇(正反匹配度為860/883)和葉醇(正反匹配度為858/879)，僅根據(jù)匹配度很難確定未知化合物。通過對比保留指數(shù)進行驗證，可知3-己烯醇和葉醇的保留指數(shù)文獻值分別為1 391和1 382，計算保留時間31.100 2 min的未知化合物保留指數(shù)為1 391.99，將文獻引用值與計算值比對，很容易確定該化合物為3-己烯醇。保留指數(shù)法可提高香氣成分鑒定的準(zhǔn)確性，在玫瑰花露香氣成分的定性分析中具有應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗，優(yōu)化了頂空固相微萃取法提取玫瑰花露香氣成分的條件。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測萃取的玫瑰花露香氣成分，并利用AMDIS和保留指數(shù)對其組分進行定性分析，從玫瑰花水和玫瑰細胞液中共鑒定出60種香氣組分，其中玫瑰花水59種，玫瑰細胞液22種，玫瑰花水和玫瑰細胞液共有成分21種，相對含量之和分別為76.60%、78.42%；玫瑰花水38種特有成分，相對含量之和為15.26%；玫瑰細胞液1種特有成分，相對含量為0.60%。結(jié)果表明，該定性方法克服了常規(guī)譜庫檢索的不確定性，幾種方法相互驗證、相互支撐，進一步提高了定性結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，該定性思路也可用于其他復(fù)雜樣品揮發(fā)性成分的檢測。