液相色譜串接質(zhì)譜儀測(cè)定有機(jī)茶葉中的苦參堿與氧化苦參堿

李 麗

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院鎮(zhèn)江分院 鎮(zhèn)江高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

苦參堿、氧化苦參堿屬于喹諾里西啶類生物堿，廣泛存在于豆科的槐屬、野決明屬及山豆根屬等植物中[1-2]?？鄥A、氧化苦參堿對(duì)于治療結(jié)核病、潰瘍性結(jié)腸炎、乙型肝炎以及癌癥的輔助治療都有一定的療效，在醫(yī)學(xué)上得到了廣泛的應(yīng)用[3-7]。在植物的病蟲(chóng)害防治方面，苦參堿、氧化苦參堿可以有效防治竹斑蛾[8]、對(duì)異色瓢蟲(chóng)[9]、茶毛蟲(chóng)[10]等病蟲(chóng)害，是良好的殺蟲(chóng)劑。中國(guó)是世界最大的茶葉生產(chǎn)和貿(mào)易國(guó)，也是歐盟茶葉的最大輸入國(guó)，僅2014年中國(guó)出口到歐盟的茶葉就有2.49萬(wàn)t，貨值達(dá)到1.04億美元，其中有相當(dāng)一部分是有機(jī)茶葉[11-12]。中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)產(chǎn)品》（GB/T 19630.1—2011）[13]，明確規(guī)定苦參堿、氧化苦參堿可以作為殺蟲(chóng)劑投入品進(jìn)行使用，且沒(méi)有最大殘留限量的規(guī)定。但是近年來(lái)，歐盟加強(qiáng)了對(duì)茶葉中農(nóng)藥殘留的監(jiān)控，其監(jiān)控項(xiàng)目由過(guò)去的458項(xiàng)增加到現(xiàn)在的將近600項(xiàng)。對(duì)于沒(méi)有授權(quán)使用的農(nóng)藥，其最大允許殘留限量均采用了一律標(biāo)準(zhǔn)，要求不得大于10μg/kg。僅今年9月份，西班牙就在歐盟快速預(yù)警平臺(tái)上公布了3起從中國(guó)進(jìn)口紅茶中檢出未經(jīng)授權(quán)使用的化學(xué)物質(zhì)苦參堿，并且在口岸自動(dòng)拒收，給出口商造成了很大的損失。

目前檢測(cè)苦參堿、氧化苦參堿的方法包括：氣相色譜法[17]、高效液相色譜法、滴定法、薄層色譜法、比色法、瑞利散射法、液相色譜串接質(zhì)譜法。這些方法有的是針對(duì)苦參堿、氧化苦參堿的制品或者生物檢樣，并不針對(duì)茶葉樣品；有些檢測(cè)植物產(chǎn)品的方法，樣品前處理的過(guò)程復(fù)雜，提取凈化耗時(shí)長(zhǎng)，重復(fù)性不佳，影響檢測(cè)的周期。到目前為止，我國(guó)尚未制定出同時(shí)檢測(cè)茶葉中苦參堿、氧化苦參堿含量的標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要建立檢測(cè)方法對(duì)茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的含量進(jìn)行本底調(diào)查，確保茶葉的安全質(zhì)量，規(guī)避有機(jī)茶葉出口面臨的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo TSQ Quantan Access液相色譜-串接質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）和自動(dòng)進(jìn)樣器（Finnigen Surveyor）；XPE205電子天平：感量0.01mg（梅特勒公司，瑞士）；DS-1組織搗碎機(jī)（上海右一儀器有限公司，中國(guó)）；3K15高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)）；SB-1000YDTA超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó)）。

1.2 試劑及耗材

乙腈，乙醇：均為色譜純（Merck公司，德國(guó)）；氨水，三氯甲烷，氯化鈉：均為分析純（上海國(guó)藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水（Millipore公司，美國(guó)）；N-丙基乙二胺固體粉末（PSA，上海安普公司）；石墨化炭黑（GCB，深圳逗點(diǎn)公司）。

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（CAS：519-02-8 分子式C15H24N2O）購(gòu)自廣州碩譜生物科技有限公司（1 000 μg/mL），于4℃保存；氧化苦參堿（CAS：16837-52-8 分子式C15H24N2O2）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，純度大于98%。標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量的氧化苦參堿，用乙腈配制成1 000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃保存。臨用時(shí)將苦參堿、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液等體積混合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用乙腈稀釋至適當(dāng)濃度用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣加標(biāo)。

1.3 樣品處理

（1）用于實(shí)驗(yàn)的20份樣品均從本地市場(chǎng)、上海、福建等地采購(gòu)。

（2）取300g茶葉，用組織搗碎機(jī)充分打碎，過(guò)100目篩子，取篩下物混合均勻備用。

（3）樣品的提取凈化

①稱取茶葉0.500g（±0.002）于50mL離心管中，加入10mL去離子水渦旋30s，水浴20min（50℃）后超聲20min。加入100μL濃氨水渦旋30s，加入1g氯化鈉渦旋2min，加入20mL三氯甲烷渦旋2min超聲20min。以8 000r/min（離心半徑8cm）離心5min后，棄去上層的水相，取15mL三氯甲烷層氮吹至干（避免將上層的水相吸入）。殘?jiān)屑尤?00mg PSA和1.0mL乙醇，超聲2min復(fù)溶，過(guò)有機(jī)相膜進(jìn)樣。

②加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用經(jīng)過(guò)檢測(cè)的不含待測(cè)組分的茶葉進(jìn)行加標(biāo)，提取凈化程序按照1.3.3.1實(shí)施。

1.4 儀器條件

Se QuantTMZic?-Hillic 親水柱（150mm×2.1mm，5um）；流動(dòng)相：A相：乙腈、D相：10mmoL/L乙酸銨（含有0.15%甲酸），梯度洗脫（表1），流速0.3mL/min；進(jìn)樣量，25μL；柱溫30℃。

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）；噴霧電壓4200V；離子源溫度380℃；輔助氣流速3mL/min；殼氣流速4mL/min；碰撞氣（氬氣）流速0.45mL/min。苦參堿的定量、定性對(duì)和碰撞能量分別為249/148.1m/z、32eV，249/150.1m/z、31eV，249/112.2m/z、32eV，249/110.2m/z、35eV，249/98.2m/z、37eV；氧化苦參堿的定量、定性對(duì)和碰撞能量分別為265/205.1m/z、30eV，265/150.0m/z、32eV，265/148.0m/z、30eV，265/136.1m/z、29eV，265/98.2m/z、34eV。標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖，如表1，圖1所示。

表1 色譜梯度洗脫條件

圖1 苦參堿、氧化苦參堿總離子流圖（濃度0.312 μg/L）

2 結(jié)果

2.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

吸取100.0μL苦參堿、氧化苦參堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0μg/L）于900.0μL乙腈中，渦旋混合均勻。再用乙腈倍比稀釋，共計(jì)6個(gè)點(diǎn)：0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0μg/L。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Y=8.19×104X-2.93×103，如圖2所示；氧化苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Y=3.62×104X-5.18×103（圖3）。結(jié)果顯示，在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，苦參堿、氧化苦參堿工作曲線有良好的線性，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。

圖2 苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.312～10.0μg/L）

圖3 氧化苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.312～10.0μg/L）

參照EPA[28]的方法，先計(jì)算儀器的檢出限和定量限。然后在儀器的定量限上做實(shí)際樣品的加標(biāo)回收，以7次平行試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的檢出限和定量限?？鄥A、氧化苦參堿的檢出限均為1.0μg/kg；苦參堿、氧化苦參堿的定量限均為2.0μg/kg。

2.2 實(shí)驗(yàn)的回收率和精密度

用三種有機(jī)茶葉的陰性樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加水平為2.00μg/kg、4.00μg/kg、10.0μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平測(cè)定6次，苦參堿的回收率70.5%～78.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.60%～7.80%，如表2所示；氧化苦參堿的回收率93.0%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.21%～5.17%（表2）。陰性樣品以及加標(biāo)樣品的總離子流圖，如圖4～5所示。

表2 茶葉陰性樣品的加標(biāo)回收率、精密度（苦參堿、氧化苦參堿）（n=6）

圖4 茶葉空白樣品提取液總離子流圖

2.3 樣品的篩查

20份有機(jī)茶葉樣品，其中有3份樣品檢出苦參堿，分別為綠茶（8.31μg/kg、12.3μg/kg）和紅茶（6.77 μg/kg），其他均未檢出。

3 討論

嘗試了C18柱、C8柱、親水柱、離子交換柱（SCX柱、MCX柱）等色譜柱用于待測(cè)組分的分離。C18、C8柱排除樣品基質(zhì)干擾的效果不佳，易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。離子交換柱對(duì)待測(cè)組分的保留性強(qiáng)，峰型較寬并且拖尾。采用親水柱，在梯度洗脫條件下，空白樣品基質(zhì)在苦參堿和氧化苦參堿的出峰處會(huì)產(chǎn)生微小的干擾峰，但是其含量不足定量限的1/5，對(duì)檢測(cè)結(jié)果以及產(chǎn)品的合規(guī)性沒(méi)有影響；待測(cè)組分的峰型、保留時(shí)間等方面，都能夠滿足相關(guān)的技術(shù)要求（圖5）。因此，選擇Se QuantTMZic?-Hillic 親水柱作為分離柱。

圖5 茶葉加標(biāo)樣品提取液總離子流圖

QuEChERS方法是檢測(cè)農(nóng)藥殘留經(jīng)常使用的技術(shù)，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其主要的試劑——石墨化炭黑（GCB）對(duì)苦參堿、氧化苦參堿有很強(qiáng)的吸附作用，基本沒(méi)有加標(biāo)回收率。茶葉中富含鞣酸，苦參堿容易與之形成鞣酸苦參堿，水溶性增大。但是試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用純水（中性的、酸化或者堿化的）、水/乙腈體系（中性的、酸化或者堿化的）、水/甲醇體系（中性的、酸化或者堿化的）、純乙腈、純甲醇，對(duì)目標(biāo)化合物的提取效果都不佳，回收率偏低，且基質(zhì)干擾較大。在茶葉樣品中加入過(guò)量的氨水可以有效中和茶葉中鞣酸之類的酸性物質(zhì)，有利于苦參堿、氧化苦參堿轉(zhuǎn)移至三氯甲烷中；水相中加入氯化鈉可以使水的飽和度增加，能夠降低苦參堿、氧化苦參堿在水相中的分配系數(shù)。通過(guò)優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)的選擇性、回收率、精密度、檢出限、定量限等指標(biāo)均符合歐盟殘留監(jiān)控指南的要求。

4 結(jié)論

本研究建立了有機(jī)茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的液相色譜串接質(zhì)譜的檢測(cè)方法。樣品用水溶解超聲萃取后，加入氨水中和茶葉中的酸性物質(zhì)；水相中加入氯化鈉后，用三氯甲烷提取待測(cè)組分，經(jīng)PSA凈化后上機(jī)測(cè)定。該方法具有良好的分離效果、線性關(guān)系，也具有理想的回收率和精密度。方法的檢出限、定量限分別為1.00μg/kg和2.00μg/kg。篩查的茶葉中有3份呈陽(yáng)性結(jié)果。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的檢測(cè)，為出口茶葉的質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。