小金釵春石斛原球莖增殖及試管苗移栽條件的優(yōu)化

鐘春水, 徐小萍, 林玉玲, 賴鐘雄

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.萬源生態(tài)股份有限公司，浙江 臺州 317523)

春石斛(Dendrobiumnobile)是蘭科石斛屬花卉，因自然花期常在春季而得名，其花大、香、艷而繁，多作盆栽生產(chǎn)，具有較高的觀賞價值[1]。目前春石斛主要采用切芽、扦插和組培三種方法進(jìn)行繁殖[2]。前兩種方法繁殖系數(shù)低，而通過優(yōu)化組培培養(yǎng)條件，可以提高春石斛原球莖增殖系數(shù)，從而提高春石斛工廠化生產(chǎn)效率。2003年毛碧增等[3]首次建立了春石斛不定芽離體再生體系，認(rèn)為6-BA主要參與春石斛不定芽誘導(dǎo)，亞精胺對其增殖與壯苗有促進(jìn)作用。王華等[4-5]研究了滅菌方法、激素種類及濃度配比等因素對春石斛組培快繁體系中叢生芽增殖、壯苗生根和煉苗移栽等方面的影響。Nambiar et al[6]研究表明，椰汁和葡萄糖更適于春石斛原球莖增殖生長；而仇碩等[7]研究表明，報春石斛叢生芽誘導(dǎo)與原球莖增殖以香蕉泥更佳，可見原球莖的最佳增殖條件因品種而異。廖飛雄等[8]研究表明，液體和固體培養(yǎng)基交替繼代能使原球莖生長同步性好、增殖系數(shù)大。光周期和植物生長調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)控春石斛開花和營養(yǎng)繁殖[9-10]。已有學(xué)者分別對春石斛再生體系和離體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[11-13]，并采用Solexa測序技術(shù)對春石斛離體培養(yǎng)過程中miRNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)miR156家族通過調(diào)控其靶基因來促進(jìn)春石斛從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變[14]。孟金玲[15]對春石斛試管苗移栽進(jìn)行了研究。

本試驗選用‘玫瑰紅’大花品種的春石斛，又名小金釵、美花石斛(以下簡稱小金釵春石斛)，在我國產(chǎn)于廣東、海南、廣西、云南和貴州等地，觀賞價值高。小金釵春石斛一般生于海拔400～1 500 m的樹上和林下巖石上，不易獲得且產(chǎn)量受限。關(guān)于小金釵春石斛組培快繁體系的建立及試管苗移栽尚未見相關(guān)報道。因此，本試驗篩選了小金釵春石斛原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基組分，并優(yōu)化其試管苗移栽條件，以期為提高小金釵春石斛工廠化生產(chǎn)效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供，來源于小金釵春石斛葉片誘導(dǎo)并長期離體保存。植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA、IBA，有機(jī)添加物為椰汁。多菌靈(50%可濕性粉劑)由安徽省無為縣腐殖酸廠生產(chǎn)，六針加密黑色遮陽網(wǎng)購自歐凡誠品淘寶店。

1.2 試驗方法

1.2.1 6-BA、IBA和椰汁對原球莖增殖的影響 在吳高杰[14]的試驗基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，進(jìn)一步優(yōu)化小金釵春石斛原球莖增殖培養(yǎng)基組分。以不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑和椰汁組合成9個處理進(jìn)行正交試驗，其中6-BA分別為1.25、1.50、1.75 mg·L-1；IBA分別為0.25、0.50、0.75 mg·L-1；椰汁分別為75、100、125 mL·L-1。以Knudson C (KC)為基本培養(yǎng)基，添加20 g·L-1白糖、5.5 g·L-1瓊脂，pH為5.6，培養(yǎng)60 d，每種處理每瓶接10簇原球莖。參考并優(yōu)化李璐[16]的方法,對小金釵春石斛原球莖增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。對處理后的原球莖分化程度、顏色、緊實程度和增殖系數(shù)等性狀進(jìn)行打分，滿分10分。根據(jù)各性狀的重要性賦予一定的權(quán)重，其中原球莖分化程度按10簇中有x1簇分化賦值，得分為10-x1，權(quán)重占20%；原球莖增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后鮮重-培養(yǎng)前鮮重)/培養(yǎng)前鮮重，按x2賦值，x2<7得分為(10·x2)/7，x2≥7則得10分，權(quán)重占50%；原球莖顏色按“白色”到“墨綠”分為10個等級，以等級(x3)進(jìn)行賦值，得分為x3，權(quán)重占15%；原球莖緊實程度按“松散”到“緊得發(fā)硬”分為10個等級，以等級(x4)進(jìn)行賦值，得分為x4，權(quán)重占15%。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 試管苗移栽條件的篩選 采用三因素兩水平L4(23)完全隨機(jī)試驗，探討是否遮光、是否消毒和苗大小兩兩組合對小金釵春石斛移栽效果的影響。(1)苗大小處理。試管苗移栽前先煉苗1周。煉苗后將試管苗移出并洗凈附著的培養(yǎng)基，按照2～3 cm和5～6 cm分為“小”和“大”兩組，置于沒有陽光直射的場所1 d。在移栽初期通過噴霧補充植株的水分，1周后正常養(yǎng)護(hù)，并在穴盤的每個穴里放8?？蒯尫省?2)消毒處理。分別將不同大小的試管苗一半數(shù)量置于1%多菌靈藥液中浸泡10 min，另一半置于水中浸泡10 min。(3)遮光處理。分別將在水草基質(zhì)中種植的試管苗一半數(shù)量置于全光照條件下培養(yǎng)，另一半置于遮陽網(wǎng)下培養(yǎng)。移栽60 d后，統(tǒng)計各處理試管苗的株高、長勢和存活率。根據(jù)各性狀的重要性賦予一定的權(quán)重并打分，滿分10分。株高按y1進(jìn)行賦值，y1<8 cm得分為(y1/8)×10，y1≥8 cm則得10分，權(quán)重占30%；長勢按葉片顏色偏淡綠且較軟和葉片顏色偏綠且較硬進(jìn)行賦值，得分分別為5和10，權(quán)重占30%；成活率按y2進(jìn)行賦值，得分為10·y2，權(quán)重占40%。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。移栽培養(yǎng)60 d期間，光照強度約為2 500 lx、光照時間為12 h·d-1,培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0對原球莖增殖系數(shù)和試管苗移栽因素進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA、IBA和椰汁對小金釵春石斛原球莖增殖的影響

2.1.1 適宜培養(yǎng)基的篩選 9種處理下的小金釵春石斛原球莖增殖性狀綜合得分見表1。Z4與Z8處理的原球莖得分較低(表1)，顏色較淡(圖1D、1H)；在Z9培養(yǎng)基上培養(yǎng)的原球莖雖然增殖系數(shù)較大且顏色濃綠，但質(zhì)地松散且分化嚴(yán)重(圖1I)；在Z6培養(yǎng)基上培養(yǎng)的原球莖綜合評分較高，且緊實程度高，分化程度很低(圖1F)。綜合表1和圖1可知，長期離體培養(yǎng)的原球莖最佳增殖培養(yǎng)基為Z6。即：KC+1.5 mg·L-16-BA+0.75 mg·L-1IBA+100 mL·L-1椰汁+20 g·L-1白糖+5.5 g·L-1瓊脂，pH值為5.6。

表1 小金釵春石斛原球莖增殖性狀的綜合評分Table 1 Comprehensive evaluation of characteristics of D.nobile protocorm-like bodies during proliferation

A～I(xiàn)分別表示在Z1～Z9培養(yǎng)基中增殖的小金釵春石斛原球莖。圖1 9種處理下小金釵春石斛原球莖的增殖形態(tài)Figure 1 Morphology of protocorm-like bodies of D.nobile during proliferation under 9 treatments

2.1.2 6-BA、IBA和椰汁對原球莖增殖的影響 采用SPSS 19.0分析6-BA、IBA和椰汁交互作用對原球莖增殖的影響。主體間效應(yīng)檢驗的F值見表2。在95%置信度下，6-BA對原球莖增殖的顯著性水平Sig.<0.05，說明具有顯著影響；IBA與椰汁對原球莖增殖的顯著性水平均為Sig.>0.05，不存在顯著差異(表2)。影響小金釵春石斛原球莖增殖效果的主次順序為：6-BA>IBA>椰汁。采用Dunnett法進(jìn)行處理間兩兩比較表明，Z1與Z6之間存在顯著差異、Z1與Z7之間存在顯著差異，其他處理間差異不顯著。說明Z1與Z6或Z7之間的因素水平組合差異對試驗結(jié)果有很大影響，均值最高的處理為Z6，綜合評分高達(dá)8.30。因此，本試驗僅6-BA對小金釵春石斛原球莖長期離體增殖培養(yǎng)有顯著影響，且影響增殖效果的主次順序為：6-BA>IBA>椰汁。

表2 影響小金釵春石斛原球莖增殖各因素主體間效應(yīng)的檢驗Table 2 Inter-subject validation on factors affecting proliferation of D.nobile protocorm-like bodies

2.2 小金釵春石斛試管苗移栽條件的篩選

在原球莖增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基組合的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對試管苗進(jìn)行移栽條件篩選。對移栽培養(yǎng)60 d的小金釵春石斛試管苗各項指標(biāo)的綜合評分見表3，移栽后的試管苗植株大小見圖2，各水平顯著性差異分析見表4。結(jié)果顯示，光照、消毒、苗大小對移栽效果的影響依次為：苗大小>消毒>遮光，均達(dá)極顯著水平，且這3個因素在95%置信度下主體間效應(yīng)的檢驗Sig.=0.000，兩兩之間不存在交互作用，說明三者之間不會相互影響。從圖2可見，用遮陽網(wǎng)遮光培養(yǎng)的小金釵春石斛試管苗(Y1、Y2、Y6和Y7)生長狀態(tài)整體顯著優(yōu)于未遮光培養(yǎng)的試管苗(Y3、Y4、Y5和Y8)，遮光處理的均值差為1.082，此時的Sig.=0.000(表4)，說明用遮陽網(wǎng)進(jìn)行遮光處理有利于小金釵春石斛試管苗的生長。用1%多菌靈對小金釵春石斛試管苗消毒10 min，均值差為-1.361，Sig.=0.000，不利于移栽。移栽時選用較大的試管苗，均值差為1.516，Sig.=0.000，說明移栽時使用較大的試管苗有利于移栽。綜上可見，小金釵春石斛試管苗移栽適宜條件為Y2處理，即移栽時選擇較大的苗，用遮陽網(wǎng)遮光處理且不用過高濃度的多菌靈對試管苗消毒過長時間。

表3 小金釵春石斛試管苗移栽試驗各因素綜合評分Table 3 Comprehensive scores for all factors investigated in the transplanting of D.nobile test-tube seedlings

表4 各水平間配對比較1)Table 4 Paired comparison of various levels

3 討論

3.1 6-BA對小金釵春石斛原球莖增殖的促進(jìn)作用

原球莖是一種無性胚，比叢生苗增殖快，有利于工廠化生產(chǎn)。通過調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的配比能夠有效提高原球莖增殖系數(shù)。周輝明等[17]、陳燕[18]研究認(rèn)為，不加激素的基本培養(yǎng)基為春石斛原球莖增殖的最適宜培養(yǎng)基，而侯大強等[19]認(rèn)為適宜濃度的細(xì)胞分裂素對于長期離體培養(yǎng)原球莖的增殖是必不可少的。本研究結(jié)果與侯大強等[19]研究結(jié)論相一致?？赡茉陂L期離體培養(yǎng)過程中，原球莖內(nèi)部已積累了較高含量的6-BA，而外源6-BA的添加使其體內(nèi)細(xì)胞分裂素合成過量，進(jìn)而抑制原球莖分化促進(jìn)增殖。

A～H分別表示Y1、Y6、Y2、Y7、Y3、Y5、Y8、Y4處理下小金釵春石斛移栽后試管苗的生長狀態(tài)。圖2 移栽后的小金釵春石斛試管苗生長狀態(tài)Figure 2 Growth of D.nobile test-tube seedlings after transplanting

3.2 6-BA、IBA和椰汁對小金釵春石斛原球莖增殖的共同影響

根據(jù)植物激素之間相互作用的原理，不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑配比能夠顯著影響細(xì)胞分化與增殖。本研究表明，1.5 mg·L-16-BA與 0.75 mg·L-1IBA能夠有效促進(jìn)原球莖增殖，并達(dá)到最佳效果，且6-BA、IBA和椰汁三因素在95%的置信度下存在交互作用，說明適宜濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑比單一生長調(diào)節(jié)劑更有利于小金釵春石斛原球莖增殖。該結(jié)果與霍山石斛類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)條件相類似[20]。椰汁作為重要的有機(jī)添加物，富含鈣、鈉、鉀、磷、鎂、蛋白質(zhì)和硫胺素等，為原球莖增殖提供營養(yǎng)能量來源。本試驗表明，添加100 mL·L-1椰汁是小金釵春石斛原球莖增殖的最佳濃度，過高會抑制其增殖生長。該結(jié)果與李汝婷等[21]對蝴蝶蘭原球莖增殖的影響因素探討結(jié)果相一致。此外，近年來，春石斛組培研究主要集中在優(yōu)良品種早期篩選、快繁及超低溫保存方面[22]，優(yōu)化原球莖增殖的組培快繁體系有利于春石斛優(yōu)良品種選育。

3.3 環(huán)境條件對小金釵春石斛試管苗移栽的影響

本研究表明，選用較大的試管苗，移栽時適當(dāng)遮光處理，但不用多菌靈消毒能夠提高小金釵春石斛試管苗移栽存活率。其原因主要包含以下三點。首先，較大的植株在移栽時對逆境具有較強的抗性，這直接影響試管苗對外界環(huán)境的適應(yīng)能力，是提高小金釵春石斛試管苗移栽存活率的關(guān)鍵。其次，用1%多菌靈對小金釵春石斛試管苗消毒10 min不利于其移栽，這與劉洪科等[23]、吳長亶[24]和葉香娟等[25]報道的情況均不相符。可能由于多菌靈濃度過高、消毒時間過長或根系在煉苗后沖洗培養(yǎng)基時受損，這些均可能影響春石斛試管苗移栽存活率。第三，移栽后適當(dāng)遮光能夠提高春石斛試管苗存活率，可能是因為試管苗的氣孔和葉綠體等結(jié)構(gòu)發(fā)育不正常，導(dǎo)致無法適應(yīng)高強度的蒸騰。因此，建議在移栽初期采用適當(dāng)遮光處理，避免苗弱導(dǎo)致的過度蒸騰進(jìn)而影響存活率。建議借鑒貴州觀賞春石斛的馴化移栽技術(shù)[26]，對小金釵春石斛試管苗出瓶后進(jìn)行假植、緩苗、馴化及定植，有助于提高存活率，促進(jìn)工廠化生產(chǎn)。