禽用疫苗總蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量初檢對(duì)生產(chǎn)的指導(dǎo)評(píng)價(jià)

康翠翠，張妹，陳小嬌，陳文平

（北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司、國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平谷綜合試驗(yàn)站，北京平谷 101206）

目前，養(yǎng)禽業(yè)是我國(guó)主流畜牧養(yǎng)殖業(yè)之一，然而，隨著禽類(lèi)各種疾病的暴發(fā)，對(duì)雞群的健康產(chǎn)生巨大的影響。 為了確保雞群健康，除做好生物安全外， 疫苗也是保護(hù)雞群健康必不可少的一員。 蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量是評(píng)價(jià)疫苗的兩種指標(biāo)。 疫苗中的蛋白質(zhì)含量過(guò)高會(huì)促使機(jī)體產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)。而疫苗中的內(nèi)毒素會(huì)作用于單核巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生一些活性因子，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[1]。 然而對(duì)于禽類(lèi)疫苗，目前尚未有關(guān)于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量的明確規(guī)定。 本文對(duì)市場(chǎng)上的幾種禽類(lèi)疫苗進(jìn)行蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素檢測(cè)， 擬了解目前禽類(lèi)疫苗蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CBA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）購(gòu)買(mǎi)自碧云天生物技術(shù)公司，鱟試劑（靈敏度0.25 EU/毫升）和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（10 EU/支）均購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司， 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。 各種禽用疫苗由各公司提供。 疫苗具體信息如表1。

表1 試驗(yàn)所用疫苗名稱(chēng)及廠家

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總蛋白質(zhì)測(cè)定

1.2.1.1 前期處理

參考《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào)》測(cè)定疫苗蛋白質(zhì)含量。 將疫苗從冰箱中取出使其恢復(fù)至常溫，上下顛倒使其混合均勻，從中取出100 微升置于1.5 毫升離心管中，加入900微升丙酮， 充分混勻后于室溫放置10 分鐘，15000 克4℃離心15 分鐘，去除上清液。 向沉淀中加入400 微升丙酮，震蕩后短暫離心，去除上清液。 再次用400 微升丙酮洗滌沉淀，震蕩后短暫離心去除上清液，將離心管蓋打開(kāi)，室溫晾干直至沉淀物為粉末狀。 每管添加100 微升去離子水，置于超聲波中超聲20 分鐘，使其充分溶解。 每種疫苗重復(fù)3 次。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

蛋白質(zhì)檢測(cè)流程嚴(yán)格按照CBA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行。

1.2.2 內(nèi)毒素檢測(cè)

1.2.2.1 疫苗前期處理

參考宋海巖等[2]的凍融方法， 取12 毫升混合均勻后的疫苗于15 毫升離心管中，置于-20℃冰箱冷凍48 小時(shí)， 取出后使其于室溫中融化，完全融化后再次置于-20℃冰箱冷凍24 小時(shí)， 取出后置于室溫中融化，3500 克離心15 分鐘，棄去上層乳狀物，吸取下層水相于5 毫升離心管中。

1.2.2.2 內(nèi)毒素限度試驗(yàn)

參考2015 年版《中國(guó)藥典》 中細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)方法。取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一只，加入1 毫升檢查用水，旋渦混勻5 分鐘。后期利用檢查用水分別制備濃度為4λ 和2λ 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品液。 利用檢查用水進(jìn)行供試品稀釋?zhuān)?λ 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品液共同配制濃度為2λ 的供試品溶液。

取鱟試劑42 只，其中2 只為陰性對(duì)照管，2只為陽(yáng)性對(duì)照管， 其余每4 只用于一種疫苗的檢測(cè)，2 只為供試品檢查管，2 只為供試品陽(yáng)性對(duì)照管。 每只鱟試劑中加入0.1 毫升檢查用水，其中陰性對(duì)照管再次加入0.1 毫升檢查用水，陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1 毫升濃度為2λ 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供試品檢查管加入0.1 毫升稀釋后的供試品，供試品陽(yáng)性對(duì)照管中加入濃度為2λ 的供試品溶液。 封閉鱟試劑管口，輕輕搖勻，將鱟試劑管垂直放入37℃恒溫箱中孵育60 分鐘，取出觀察，在取出過(guò)程中避免振動(dòng)。 將試管緩慢倒轉(zhuǎn)180°，若管底形成凝膠且凝膠不變形不從管壁脫落為陽(yáng)性，若管底未形成凝膠、凝膠變形或從管壁脫落均為陰性。 陰性對(duì)照管需為陰性，陽(yáng)性對(duì)照管和供試品陽(yáng)性管需為陽(yáng)性， 整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果才有效。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

嚴(yán)格按照CBA 試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 如下圖1 所示，表中線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，顯著相關(guān)。

圖1 按照CBA 試劑盒制作的曲線(xiàn)

2.2 疫苗蛋白質(zhì)結(jié)果

從表2 可知，按照生產(chǎn)廠家進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家的疫苗蛋白質(zhì)含量不同。 綜合而言，除鋁膠苗外，B 廠家疫苗蛋白質(zhì)含量最高， 其次是廠家D， 兩家蛋白含量均在1000 微克/毫升以上； 廠家C 和F 蛋白含量在500～1000 微克/毫升內(nèi)；廠家A 和E 蛋白質(zhì)含量在500 微克/毫升以下。

表2 各廠家各疫苗蛋白質(zhì)含量

按照單苗與聯(lián)苗進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)單苗和聯(lián)苗間蛋白質(zhì)含量并無(wú)明顯關(guān)系。

按照油苗和鋁膠苗進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)B 廠家中油苗中蛋白質(zhì)含量高于鋁膠苗。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一只用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，旋渦混合后進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?.50、0.25、0.125 和0.06 EU/毫升的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。 取鱟試劑安剖瓶18 支，分別為陰性對(duì)照2 支，各濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品4 支。 將鱟試劑用0.1 毫升檢查用水溶解后，分別加入各濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 毫升，陰性對(duì)照管加入0.1 毫升檢查用水。 輕輕混勻后封閉管口，垂直放入37℃恒溫箱中60 分鐘，觀察結(jié)果。

從表3 可知， 鱟試劑復(fù)核結(jié)果中細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.50 EU/毫升時(shí)為陽(yáng)性，內(nèi)毒素濃度為0.06 EU/毫升時(shí)凝膠結(jié)果為陰性，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。 本次靈敏度復(fù)核試驗(yàn)顯示本試驗(yàn)所用鱟試劑靈敏度為0.25 EU/毫升，與其標(biāo)識(shí)靈敏度一致。

表3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.4 內(nèi)毒素凝膠限度試驗(yàn)

按照中國(guó)藥典方法對(duì)各疫苗進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。 如表4 可知，8 種疫苗中有3 種疫苗內(nèi)毒素含量大于50EU/毫升，其余5 種疫苗含量均小于50 EU/毫升。

表4 各廠家各疫苗內(nèi)毒素含量

3 討論

本文參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的檢測(cè)口蹄疫滅活苗蛋白質(zhì)含量方法對(duì)各種疫苗進(jìn)行總蛋白質(zhì)含量檢測(cè)，參考中國(guó)藥典2015 版細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)方法檢測(cè)各疫苗內(nèi)毒素含量。 結(jié)果顯示不同疫苗其蛋白質(zhì)含量和內(nèi)毒素含量差異明顯，尤其是蛋白質(zhì)含量差異較大。 疫苗中雜蛋白質(zhì)含量過(guò)高可能會(huì)引起雞群局部發(fā)熱， 停食甚至死亡。

目前對(duì)于禽類(lèi)疫苗中蛋白質(zhì)含量未有明顯的規(guī)定。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的口蹄疫疫苗中蛋白質(zhì)含量為小于500 微克/毫升， 疫苗內(nèi)毒素含量為小于50 EU/毫升。 本研究中疫苗蛋白質(zhì)含量最低為B 廠家的傳染性鼻炎 （A 型） 滅活疫苗（鋁膠苗）182 微克/毫升， 最高為B 廠家的禽腦脊髓炎滅活疫苗， 蛋白含量可達(dá)3822 微克/毫升，遠(yuǎn)超500 微克/毫升。兩種疫苗蛋白含量差距可達(dá)20 倍。 說(shuō)明疫苗蛋白質(zhì)含量與生產(chǎn)廠家無(wú)必要聯(lián)系，可能與疫苗制備工藝有關(guān)。 本文檢測(cè)的8 種疫苗中其中5 種疫苗蛋白含量超過(guò)500微克/毫升， 說(shuō)明目前禽用疫苗中蛋白質(zhì)含量較高。

疫苗中內(nèi)毒素含量是目前各方最為關(guān)注的問(wèn)題， 疫苗內(nèi)毒素含量過(guò)高會(huì)影響機(jī)體健康[2]。本研究檢測(cè)的8 個(gè)疫苗中有3 個(gè)疫苗內(nèi)毒素含量超過(guò)50 EU/毫升， 說(shuō)明大部分疫苗內(nèi)毒素含量低于50 EU/毫升。 此外內(nèi)毒素含量大于50 EU/毫升的疫苗分別屬于3 個(gè)廠家，說(shuō)明內(nèi)毒素含量的高低與廠家并無(wú)直接關(guān)系， 與各疫苗的制作工藝有關(guān)。

本文通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上禽類(lèi)疫苗進(jìn)行蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量檢測(cè)， 初步了解禽類(lèi)疫苗中蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的含量范圍， 為后期疫苗中蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的檢測(cè)提供了方法， 同時(shí)為疫苗的質(zhì)量評(píng)估提供了數(shù)據(jù)支撐。