Hg2+腎細(xì)胞毒性量效關(guān)系及其腎臟蓄積機(jī)理與針灸減毒的探究

胡英華，賈炳超，于立清，尚 鑫，孫 波

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

朱砂具有鎮(zhèn)靜、安神功效，但因其同時(shí)具有毒性又嚴(yán)重地困擾著醫(yī)藥界，所以針對朱砂毒性的研究經(jīng)久不衰[1-4]。由于大多研究結(jié)果都將朱砂的毒性聚焦于朱砂中的主要成分重金屬汞，故汞在機(jī)體臟器的蓄積與存在形式[5-7]、汞的代謝動(dòng)力學(xué)[8-10]與代謝組學(xué)[11-16]等研究都成了熱門話題。然而，對朱砂藥性與毒性作用的量效關(guān)系研究較少。朱砂的主要成份是HgS，但HgS 溶解度很小，僅為2.943×10-25g，并且HgS 本身不能被吸收，這就意味著可以通過微孔途徑被吸收的Hg2+量很小。如此少量的Hg2+是如何經(jīng)有限的服藥期便產(chǎn)生蓄積的呢？蓄積量達(dá)到多少才能對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響呢？這無疑是涉及朱砂或含有朱砂成份的中成藥能否安全用于臨床的關(guān)鍵問題。為了解決上述問題，同時(shí)也考慮到朱砂的毒性主要源于其對腎臟的損害，筆者以HEK293 為模型研究了朱砂體外腎毒性的量效關(guān)系，并以家兔血液中的Hg2+C-t 關(guān)系與其小腸和腎臟的離體實(shí)驗(yàn)揭示了存在于吸收過程的Hg2+的蓄積機(jī)理，探究針灸的減毒作用。有研究表明，針刺天樞、足三里、上巨虛、大腸俞等可以改善結(jié)腸動(dòng)力，使排便困難程度得以改善。針刺還可以通調(diào)三焦腑氣，恢復(fù)大腸傳導(dǎo)功能，增強(qiáng)腸道平滑肌蠕動(dòng)，從而達(dá)到治愈便秘的目的[17]?，F(xiàn)代生物學(xué)研究也證明，針刺可通過調(diào)節(jié)患者腦腸肽、c-kit 蛋白及mRNA 表達(dá)來改善便秘癥狀[18-19]。考慮到治愈便秘實(shí)際上就是增強(qiáng)腸道對其內(nèi)容物的推進(jìn)作用，而這種作用剛好可以減弱朱砂微粒在腸道內(nèi)壁的吸附力，從而促進(jìn)朱砂微粒的排泄，縮短Hg2+吸收相，進(jìn)而減少由此引起的Hg2+在腎臟的蓄積。鑒于天樞、上巨虛、足三里、大腸俞這四個(gè)穴位均可以增加胃腸道動(dòng)力，故以這四個(gè)穴位的組合來研究針灸對朱砂的解毒作用。

1 Hg2+腎細(xì)胞毒性量效關(guān)系模型

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SANYO 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），SANYO 超低溫冰柜（日本 SANYO公司），Themo 生物安全柜，BIO-RAD 酶標(biāo)儀（美國伯樂公司），Mettler Toledo AL 204 電子分析天平（萬分之一），TD 40 臺(tái)式低速離心機(jī)（4 000 r/min）（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），YXQ-LS-50 立式壓力蒸汽滅菌器，可調(diào)微量移液器（上海亞榮生化儀器廠），水飛朱砂（河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司），硫化汞（北京化工廠），氯化汞（姜堰市環(huán)球試劑廠），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM 干粉培養(yǎng)基（GIBCO），胰蛋白酶（北京鼎國昌盛有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 由于汞是朱砂的主要成分，也是其腎毒性的主要來源，所以該實(shí)驗(yàn)用HgCl2來研究朱砂腎毒性與時(shí)間和劑量的相關(guān)性。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取同批次對數(shù)生長期HEK 293，用0.01 mol/L 的PBS 潤洗3 次，再用0.25%胰酶消化2 min，然后加入100 μLfalse 血清終止消化，與4 mL DMEM 混勻，以1 000 r/min 離心5 min。棄去上清液，與10%高糖DMEM 混勻于培養(yǎng)皿中，計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)入96 孔板（1.5 萬/孔），放入CO2培養(yǎng)箱中，5% CO2，37℃孵育24 h。取出，吸凈培養(yǎng)液，加入1%FBS 高糖培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出，顯微鏡下觀察生長情況（細(xì)胞應(yīng)長滿96-孔板的80%～90%），分別加入事先配置好的HgCl2溶液，在5%CO2，37 ℃孵育36 h，取出，于倒置顯微鏡下觀察，并于每孔加入20 μL falseMTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，并于每孔加入160 μLfalse 二甲基亞砜，置渦旋振蕩器上，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm 處測量各孔的吸光值，10 min 內(nèi)測完。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 可以擬合出吸光度y 與Hg2+的濃度x 之間關(guān)系的動(dòng)力學(xué)模型：Lny=ln1.0173 -0.136x。當(dāng)Hg2+濃度在0～20 μg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，該動(dòng)力學(xué)模型吻合度很好。

2 朱砂在家兔腎臟蓄積機(jī)理及針灸減毒的研究

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 AFS-930 原子熒光分光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司），SANYO 超低溫冰柜（日本SANYO公司），Mettler Toledo AL 204電子分析天平（萬分之一），TD 40 臺(tái)式低速離心機(jī)（4 000 r/min）（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），Sigma 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司），可調(diào)微量移液槍（上海亞榮生化儀器廠），康牌針灸針（0.25 mm×25 mm）（長春愛康醫(yī)療器械有限公司），水飛朱砂（批號(hào)：20141213）安國市藥材天然粉貿(mào)易有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 將市售的朱砂加工成不同分散度的供試樣品，并且按照分散度分成不同的實(shí)驗(yàn)組。將樣品置于4℃恒溫環(huán)境下，在40 KHz 超聲震蕩下溶出，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，分析。結(jié)果見表1。

表1 分散度與汞離子溶出度的相關(guān)性

根據(jù)表1 的結(jié)果，并考慮汞在體內(nèi)的表觀分布容積的問題，選擇過6 號(hào)篩、溶出60 min、Hg2+含量最高的溶液（8.561 μg/mL）作為朱砂飽和溶液實(shí)驗(yàn)組給藥供試品，取沉淀物0.5 mL 稀釋至2 mL 作為朱砂混懸液實(shí)驗(yàn)組給藥供試品。

2.2.1 血液中Hg2+濃度動(dòng)態(tài)變化 將32 只家兔隨機(jī)分為4 組，第1 組為陰性對照組，第2 組為朱砂飽和溶液實(shí)驗(yàn)組，第3 組為朱砂混懸液實(shí)驗(yàn)組，第4 組為朱砂混懸液+針灸實(shí)驗(yàn)組。第1 組的家兔灌胃給2 mL水，第2、3 組的家兔分別灌胃給2 mL 朱砂飽和溶液、2 mL 朱砂混懸液水，第4 組的家兔灌胃給2 mL 朱砂飽和溶液并每天針灸天樞、上巨虛、足三里、大腸俞四穴。

以上各組每日灌胃給藥1 次，并于每日給藥1 h后取全血進(jìn)行分析，第4 組每日于采血后針灸1 次。結(jié)果見表2。

表2 家兔血液中Hg2+濃度（，n =8） μg/mL

注：與陰性對照組比較，# P ＜0.05

2.2.2 小腸洗脫液中Hg2+濃度動(dòng)態(tài)變化 于給藥后的第15 天全部處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出小腸和腎臟。并截取小腸1 m，洗凈，用模擬腸液以每分鐘1 滴的流速?zèng)_洗，于每日中午取樣分析，結(jié)果見表3。

表3 小腸洗脫液中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

表3 小腸洗脫液中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

注：與陰性對照組比較，# P ＜0.05；與朱砂飽和溶液實(shí)驗(yàn)組比較，△P ＜0.05

2.2.3 腎臟中Hg2+濃度 用組織勻漿機(jī)將腎臟制成勻漿，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中，用Sigma 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)在-4℃下、14 000 r/min 的條件下離心15 min，取上清液1 mL 于原子熒光分析，結(jié)果見表4。

表4 腎臟中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

表4 腎臟中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

3 討論

根據(jù)Hg2+腎細(xì)胞毒性量效關(guān)系模型可以得出這樣的推論。當(dāng)Hg2+濃度不高于20 μg/mL 時(shí)，HEK293 的存活量隨著Hg2+濃度的增加而呈對數(shù)衰減。當(dāng)Hg2+濃度為5.2 μg/mL 時(shí)，HEK293 的存活率為對照組的50%。

總結(jié)2.2.1、2.2.2 和2.2.3 項(xiàng)下第2 實(shí)驗(yàn)組與第3實(shí)驗(yàn)組的研究結(jié)果可知。朱砂具有很強(qiáng)的吸附性，過量的朱砂微小顆粒以其強(qiáng)吸附性附著在小腸內(nèi)壁，這就使得Hg2+可以緩慢地溶解于腸液，并持續(xù)地被吸收，其結(jié)果相當(dāng)于給藥劑量不斷地增加，給藥時(shí)間相應(yīng)地延長，進(jìn)而導(dǎo)致朱砂因過度吸收而在腎臟蓄積，從而導(dǎo)致腎毒性的增加。如果中成藥能夠按照朱砂的溶解度投料，那么就可以參照朱砂腎毒性的量效關(guān)系控制含有朱砂制劑的給藥量及安全用藥周期，從而實(shí)現(xiàn)臨床上的精準(zhǔn)用藥。

分析2.2.1、2.2.2 和2.2.3 項(xiàng)下第3 實(shí)驗(yàn)組與第4實(shí)驗(yàn)組的研究結(jié)果可以做出這樣的預(yù)測。對于口服含有朱砂藥物者，針灸刺激天樞、上巨虛、足三里、大腸俞這四個(gè)穴位可以減少朱砂微粒附著在小腸內(nèi)壁的時(shí)間，縮短朱砂的吸收相，從而起到減毒作用，這一結(jié)果可以從經(jīng)絡(luò)理論找到依據(jù)。天樞是手陽明大腸經(jīng)的募穴，也是人體氣機(jī)升降的關(guān)鍵部位，可使臟腑之氣通調(diào)。上巨虛是手陽明大腸經(jīng)的下合穴，根據(jù)《靈樞·四時(shí)氣》：“邪在腑，治其合。”的理論，針刺上巨虛來通調(diào)腑氣，其二者又為“合募配穴法”的應(yīng)用，可起到相互協(xié)調(diào)的作用，從而增強(qiáng)療效。天樞，位于人體上部，上巨虛，位于人體下部，亦屬于配穴方法中的“上下配穴法”，上下部的腧穴聯(lián)合使用，可以通調(diào)人體內(nèi)的氣機(jī)，從而消除腑病。足三里是足陽明胃經(jīng)中的重要穴位，《四總穴歌》里有“肚腹三里求”的論述，其高度概括了足三里穴的主治功效，表明通過刺激足三里穴可明顯改善胃腸道疾病和不適癥狀，而足陽明胃經(jīng)又被稱之為“多氣多血之經(jīng)”，因此刺激足三里可明顯改善人體內(nèi)氣血運(yùn)行。天樞、上巨虛、足三里組合使用更是可以加強(qiáng)腸道的氣血經(jīng)氣的運(yùn)行，加快大腸傳導(dǎo)功能恢復(fù)。大腸俞作為背俞穴，有瀉熱通便、理氣化滯、通調(diào)腸腑的功效，與天樞聯(lián)合使用屬于“俞募配穴法”，由于背俞穴和募穴都是臟腑之氣輸注和會(huì)聚的部位，在分布上大體與對應(yīng)的臟腑所在部位的上下排列相接近，因此，主要用于治療相關(guān)臟腑的病證發(fā)揮其協(xié)同作用，從而增加療效。