活血通絡(luò)藥物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠凋亡軟骨細(xì)胞體外干預(yù)的影響

韋佳佳，廖建青，張英杰，王 琦*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明 650021；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是全世界范圍內(nèi)常見的慢性、進(jìn)行性的骨關(guān)節(jié)疾病[1-3]。生理狀態(tài)下，膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持細(xì)胞數(shù)量及功能的穩(wěn)定。然而，一旦軟骨細(xì)胞發(fā)生過度凋亡就會(huì)打破這一動(dòng)態(tài)平衡，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡是導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退行性病變的關(guān)鍵性因素[4-6]。而近年來中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）、抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，中醫(yī)藥能抑制KOA 炎癥保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、緩解關(guān)節(jié)疼痛已經(jīng)得到證實(shí)，中醫(yī)藥不僅具有整體治療、辨證論治個(gè)性化等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，還可明顯改善患者的生活質(zhì)量[7-9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，瘀血貫穿于整個(gè)KOA 病程的始終，故運(yùn)用活血化瘀通絡(luò)治療KOA 也貫穿于整個(gè)疾病的治療過程[10]。有研究表明，運(yùn)用活血通絡(luò)中藥治療早期KOA時(shí)在總有效率、不良反應(yīng)率、KSS評(píng)分等方面均優(yōu)于NSAIDs[11]。為了深入研究驗(yàn)證，本次實(shí)驗(yàn)擬選用正常小鼠軟骨細(xì)胞和KOA 小鼠凋亡軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、細(xì)胞傳代，在培養(yǎng)傳代成功的基礎(chǔ)上，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分別以具有活血通絡(luò)作用的不同血清濃度骨痹合劑、氨糖美辛、生理鹽水干預(yù)后，觀察活血通絡(luò)藥物對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。以此對(duì)活血通絡(luò)藥物的機(jī)制進(jìn)行初步的驗(yàn)證，并為下一步實(shí)驗(yàn)提供前期基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取SPF 級(jí)正常小鼠、KOA 造模小鼠各80 只。體質(zhì)量（19.6±0.6）g。動(dòng)物接收、滅菌后將小鼠置于IVC 動(dòng)物房中，將小鼠隨機(jī)放入小鼠籠中，每籠5 只，共16 籠。正常飼養(yǎng)，室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度42%～53%，常規(guī)飲食，日照時(shí)間為每天10～12 h，空氣流通。C57小鼠（南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001），IVC 動(dòng)物飼養(yǎng)系統(tǒng)（蘇州蘇杭科技）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 II 型膠原酶（ThermoFisher，17101015），PBS（南京生興，SN331），胰酶（Hyclone，SH30042.01），DMEM/F12（Hyclone，SH30023），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，3131），甲苯胺藍(lán)染色 液（Leagene，DB0057），多聚甲醛（aladdin，C104188），II 型膠原酶（ThermoFisher，17101015），DMSO（sigma，C6295-50 mL），F(xiàn)BS（Hyclone，SH30070.03），顯微鏡（Nikon，Ts2R），RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone，SH30809），F(xiàn)BS（Hyclone，SH30070），PI-AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（eBioscience，BMS500FI），冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5430），流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACScalibur），DMEM/F12（Hyclone，SH30023.01B），胎牛血清（Hyclone，SH30070.03），青霉素/ 鏈霉素（Hyclone，SV30010），血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化），MTT（beyotime，C0009），CO2培養(yǎng)箱（Thermo fisher，3131），酶標(biāo)儀（Thermo fisher，Multiskan 51119000）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 骨痹合劑（滇藥制字（Z）04A01888）由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，氨糖美辛腸溶片（國藥準(zhǔn)字H20023171）由上海華中藥業(yè)有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)小鼠80 只，質(zhì)量20～25 g，20 只用于軟骨細(xì)胞取材，其中10 只用于正常軟骨細(xì)胞取材，10只用于建立KOA軟骨細(xì)胞取材，60 只用于含藥血清制備。

2.2 KOA 小鼠模型的建立 取10 周齡SPF 級(jí)C57 雄性小鼠10 只，4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，小鼠腿部膝關(guān)節(jié)處剃毛，膝關(guān)節(jié)部位備皮消毒，取髕旁內(nèi)側(cè)切口顯露膝關(guān)節(jié)，顯露髕骨向外側(cè)脫位，盡量屈曲膝關(guān)節(jié)顯露前交叉韌帶后切斷，止血后將髕骨復(fù)位，關(guān)節(jié)腔逐層閉合。術(shù)后3 d 每天每只肌肉注射青霉素預(yù)防感染。剩余10 只為正常組軟骨細(xì)胞取材。

2.3 含藥血清的制備方法 骨痹合劑組小鼠以骨痹合劑灌胃，氨糖美辛組小鼠以氨糖美辛腸溶片溶于同體積蒸餾水灌胃，生理鹽水組小鼠以同體積生理鹽水灌胃，每組20 只，藥物劑量和濃度按人與小鼠正常藥量比進(jìn)行換算（Meeh Rubner 公式）的3 倍，每日上午、和下午各1 次，連續(xù)3 d，末次灌胃2 h 后麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈采血，4 ℃靜置過夜后離心，取血清56 ℃滅活30 min，過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng) 用手術(shù)刀切出脛骨和股骨端部軟骨，放入PBS 中，收集完所有軟骨組織后，切碎，轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清PBS，加入足量II 型膠原酶和胰酶消化3～6 h，收集細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足DMEM/F 12 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，48 h 后換液，觀察細(xì)胞狀態(tài)。每2 d 更換新的完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入PBS 洗1～2 次，去除PBS 后，加入1 mL 胰酶消化2 min 后，加入3 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，消化的細(xì)胞離心，倒掉上清，加入3 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1:3 傳代至培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d 后將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，置于超凈臺(tái)中，輕輕去除培養(yǎng)基，加入PBS 洗1 次，去除PBS 后，加入1 mL 胰酶，搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中消化2 min，細(xì)胞消化結(jié)束后，加入3 mL 完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，將消化的細(xì)胞離心。離心結(jié)束后倒掉上清，傳代的細(xì)胞加入培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸后將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)正常，細(xì)胞融合度在90%，2 d 后再次將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，置于超凈臺(tái)中，輕輕去除培養(yǎng)基，加入PBS 洗1 次，去除PBS 后，加入1 mL 胰酶，搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中消化2 min，細(xì)胞消化結(jié)束后，加入3 mL 完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 000 r/min離心5 min。離心結(jié)束后倒掉上清，傳代的細(xì)胞加入培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸后將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種部分細(xì)胞至24 孔板中，做甲苯胺藍(lán)染色鑒定。需要凍存的細(xì)胞，加入細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管中，標(biāo)記后放入細(xì)胞凍存盒中置于-80 ℃冰箱中凍存。凍存液：FBS 和DMSO 9:1。

2.5 甲苯胺藍(lán)染色 將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，將細(xì)胞置于顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況以及細(xì)胞狀態(tài)。將24孔板中培養(yǎng)基去除培，用PBS 清洗1 次，加入1 mL多聚甲醛常溫固定細(xì)胞10 min，去除多聚甲醛，用PBS 清洗2 次。每孔加入甲苯胺藍(lán)工作液500 μL，室溫染色30 min。棄去染色液，用自來水清洗數(shù)次顯色。顯微鏡下觀察染色效果，拍照。

2.6 MTT 檢測(cè) 將長(zhǎng)到培養(yǎng)皿80%～90%的正常軟骨細(xì)胞和KOA 軟骨細(xì)胞用胰酶消化下來，1 000 r/min離心，去除上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分別種在96 孔板中，每孔種3 000 個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，加入含藥血清5%、10%、20% 3 個(gè)濃度的骨痹合劑、氨糖美辛和生理鹽水的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)2、4、6、8 d 后，加入10 μL MTT（5 mg/mL），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約3 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，在570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 正常小鼠和KOA 小鼠軟骨細(xì)胞加入骨痹合劑、氨糖美辛以及生理鹽水培養(yǎng)到指定時(shí)間點(diǎn)。收集培養(yǎng)上清，用胰酶消化貼壁的細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。（將細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞和貼壁細(xì)胞全部收集到離心管中）。用預(yù)冷的PBS 洗3 次細(xì)胞，4 ℃，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入1 mL binding buffer 洗細(xì)胞，4 ℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入100 μL binding buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL PI 和5 μL FITC-Annexin V，混合均勻，常溫避光孵育15 min，加入400 μL binding buffer 混勻，立刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集和分析數(shù)據(jù)，輸出報(bào)告。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 小鼠關(guān)節(jié)軟骨原代細(xì)胞形態(tài)及鑒定 小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成功提取，顯微鏡下觀察可見軟骨細(xì)胞呈多角形、梭形單層覆蓋于培養(yǎng)皿底部。培養(yǎng)后見細(xì)胞狀態(tài)正常，將原代細(xì)胞以1:3 傳代至培養(yǎng)皿。正常小鼠軟骨細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，KOA 模型的軟骨細(xì)胞增殖能力較弱。見圖1。

圖1 為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞白光圖

將傳代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下軟骨細(xì)胞多呈多角形，胞質(zhì)呈均質(zhì)狀，較疏松，大部分可見到核仁，少數(shù)也可見分裂相，細(xì)胞漿和胞膜呈藍(lán)色，所有的細(xì)胞都被甲苯胺藍(lán)著色，表明都是軟骨細(xì)胞。見圖2。

圖2 為分離提取的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

3.2 MTT 檢測(cè)結(jié)果 見圖3。

圖3 不同濃度（骨痹合劑組、氨糖美辛組、生理鹽水組）含藥血清處理軟骨細(xì)胞2、4、6、8 d 檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從結(jié)果中可以看出，骨痹合劑組及氨糖美辛組均可抑制軟骨細(xì)胞凋亡，一定程度促進(jìn)細(xì)胞增殖。而在不同濃度骨痹合劑組中，10%含藥血清相對(duì)于5%和20%含藥血清濃度更加促進(jìn)細(xì)胞增殖，說明10%含藥血清濃度相對(duì)為最佳濃度。并且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，2 d 的時(shí)間點(diǎn)各組增殖變化最為明顯。

3.3 骨痹合劑、氨糖美辛以及生理鹽水干預(yù)細(xì)胞凋亡的觀察 見表1，圖4。

圖4 凋亡結(jié)果十字散點(diǎn)圖

表1 骨痹合劑、氨糖美辛以及生理鹽水干預(yù)細(xì)胞凋亡的觀察

從凋亡結(jié)果圖中可以看到畫十字的散點(diǎn)圖，左上象限是死細(xì)胞，左下象限是正?；罴?xì)胞，右下象限是早期凋亡細(xì)胞，右上象限是晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)的右上象限的細(xì)胞的比例。從結(jié)果中可以看出相對(duì)于對(duì)照組正常，KOA 模型分離出的軟骨細(xì)胞凋亡較高，在對(duì)KOA 組小鼠凋亡的軟骨細(xì)胞進(jìn)行藥物血清干預(yù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，骨痹合劑和氨糖美辛抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。

4 討論

前期研究及本次實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，KOA 軟骨細(xì)胞數(shù)量較正常軟骨細(xì)胞增殖少，觀察到與正常軟骨相比，KOA 軟骨中的凋亡軟骨細(xì)胞更多。大量研究假設(shè)，KOA 或軟骨衰老是軟骨細(xì)胞凋亡的結(jié)果。但是，KOA 也可能導(dǎo)致高水平的軟骨細(xì)胞凋亡，這些假設(shè)的差異表明軟骨細(xì)胞凋亡與軟骨損傷之間的復(fù)雜關(guān)系[12]。因此，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活的藥物開發(fā)研究至關(guān)重要。軟骨細(xì)胞的凋亡受到多種因素的影響，Bcl-2 家族途徑、抗氧化和抗炎途徑、PI3KAkt-mTOR 途徑、HIF1α 途徑，Sox9 途徑和miRNA途徑等等[13-14]。所以，目前通過介導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞的凋亡途徑來防治骨關(guān)節(jié)炎已成為目前的熱門研究。抑制凋亡為有效和安全地保護(hù)軟骨細(xì)胞抵抗KOA 提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

結(jié)合以上機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選取云南省中醫(yī)醫(yī)院使用多年院內(nèi)制劑骨痹合劑作為治療研究目標(biāo)，采用云南省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑骨痹合劑及對(duì)照組氨糖美辛不同藥物濃度對(duì)軟骨細(xì)胞干預(yù)觀察，骨痹合劑由以下主要藥物組成：當(dāng)歸、丹參、紅花、桂枝、全蝎、蜈蚣、桑寄生、杜仲、獨(dú)活等。全方以活血通絡(luò)為主，又兼具祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎之效。本方所治病證，乃因風(fēng)寒濕邪阻于經(jīng)絡(luò)，經(jīng)絡(luò)痹阻，筋骨失養(yǎng)所致。本研究中，在小鼠成功造模及前期實(shí)驗(yàn)完成的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)第二階段實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，骨痹合劑含藥血清組能夠明顯降低軟骨細(xì)胞凋亡模型中軟骨細(xì)胞的凋亡率，可能與骨痹合劑組能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用有關(guān)。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中觀察后確定，10%骨痹合劑含藥血清濃度為促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的相對(duì)最佳濃度，培養(yǎng)2 d 后不同組別之間的細(xì)胞增殖變化最明顯，為下一步研究中對(duì)信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡的檢測(cè)研究，確定給藥濃度及對(duì)干預(yù)時(shí)間點(diǎn)做出預(yù)判。