半夏生物總堿對癲癇大鼠行為學(xué)、腦組織病理學(xué)及BDNF/Trk-B 表達(dá)的影響

鄧楚欣，于征淼，林培政，吳智兵*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心腦病科，廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)溫病教研室，廣州 510000）

癲癇是一組病因及臨床表現(xiàn)復(fù)雜的疾病，其標(biāo)志性癥狀為自發(fā)癇性發(fā)作（spontaneous recurrent seizure，SRS）；隨著癲癇病理機(jī)制（epileptogenesis）的發(fā)展，常合并行為、認(rèn)知及精神方面的功能障礙。癲癇長期管理的發(fā)展目標(biāo)涵蓋3 個方面：控制癇性發(fā)作、改善癲癇合并癥、抑制或逆轉(zhuǎn)腦組織病損。現(xiàn)存的抗癇藥（anti-epileptic drugs，AEDs）能有效控制癇性發(fā)作，但難以改善癲癇慢性病程[1-2]。半夏為天南星科多年生草本半夏的干燥塊莖，在中醫(yī)臨床中常用于治療以頑痰為本的癇病。半夏生物總堿（pinellia total alkaloids，PTA）可能是治療癲癇的活性成分之一[3-4]。本研究用匹羅卡品（pilocarpine，PILO）建立大鼠癲癇模型[5]，以托吡酯為對照，評價半夏生物總堿對空間工作記憶能力、自主活動量、海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量、齒狀回（dentate gyrus，DG）苔蘚纖維發(fā)芽（Mossy fiber sprouting，MFS）現(xiàn)象以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和絡(luò)氨酸蛋白激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）蛋白表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF 級4～5 周齡雄性SD 大鼠92只，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗室 [SYXK（粵）2013-0092]，可自由取食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后體質(zhì)量為（213.0 ± 12.03）g。半夏生物總堿（南京道斯夫，批號170325R）、托吡酯（大連美侖，批號F0601A）、PILO（Sigma-Aldrich，批號MKBW5175V）、氯化鋰（LiCl）（Sigma-Aldrich，批號SLBP9949V）、甲基溴化東莨菪堿（methscopolamine bromide，MSB）（上海阿拉丁，批號E1529108）和水合氯醛（天津大茂，批號20160905）分別溶于生理鹽水（normal saline，NS）（四川科倫，批號A17020606-1）。5%葡萄糖氯化鈉注射液（glucose solution 加NS，GS 加NS）（四川科倫，批號A16070305-2）。

1.2 行為學(xué)測試 Y 臂迷宮用于強(qiáng)迫路線轉(zhuǎn)換測試（forced alternation test，F(xiàn)AT）和自發(fā)路線轉(zhuǎn)換測試（spontaneous alternation test，SAT），有3 條外觀一致、互相呈120°的臂；曠場活動（open field locomotion，OFL）箱長90 cm、寬90 cm、高50 cm。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行第1 次行為學(xué)測試，治療結(jié)束后進(jìn)行第2 次行為學(xué)測試。FAT 采集“目標(biāo)臂停留時間”和“強(qiáng)迫路線轉(zhuǎn)換行為（forced alternation behavior，F(xiàn)AB）”，計算FAB%=（組內(nèi)正確選擇目標(biāo)臂的大鼠只數(shù)/組內(nèi)大鼠只數(shù)）×100%；SAT 采集“自發(fā)路線轉(zhuǎn)換行為（spontaneous alternation behavior，SAB）”，計算SAB%={SAB 次數(shù)/（總進(jìn)入臂次數(shù)-2）}×100%；OFL 采集“進(jìn)入格數(shù)”和“中心停留時間”[6-8]。

1.3 分組、造模、給藥及取材 第1 次行為學(xué)測試后，92 只大鼠隨機(jī)分為正常對照組18 只，模型組74 只。首先腹腔注射（intraperitoneal injection,ip）LiCl（127 mg/kg），17.5 h 后予MSB（1 mg/kg，ip）；再0.5 h后，模型組予PILO（30 mg/kg，ip），正常對照組予等量NS ip。首劑PILO 注射30 min 后如大鼠未進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus，SE），追加1次PILO（10 mg/kg），最多追加4 次。SE 持續(xù)90 min 為造模成功，隨后予7%水合氯醛（350 mg/kg，ip）終止發(fā)作，正常對照組在相應(yīng)時點執(zhí)行，水合氯醛注射20 min 后如發(fā)作仍未完全停止可追加1 次（87.5 mg/kg,ip）。自癲癇持續(xù)狀態(tài)當(dāng)天起，全部大鼠連續(xù)5 d 予GS 加NS（4 mL，ip）。按Racine 分級界定癇性發(fā)作級別，按Brandt 等的方案界定癲癇持續(xù)狀態(tài)[9-10]。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后第6 天仍存活者再隨機(jī)分為癲癇對照組（NS，n=13）、托吡酯組（0.06 g/kg，n=12）、PTA 低劑量組（0.4 g/kg，n=10）和PTA 高劑量組（0.8 g/kg，n=12）。以上4組與正常對照組（NS，n=17）每天灌胃1次，連續(xù)14 d。第2 次行為學(xué)測試后，一部分大鼠留取新鮮腦組織后置于液氮保存，一部分大鼠經(jīng)4%多聚甲醛溶液（北京雷根，批號0313A17）行心臟灌流后留取固定腦組織。

1.4 病理染色 完成Nissl 染色（碧云天生物，批號042717170702）和Timm 染色（上海哈靈，批號20171124HL）后在顯微鏡（Olympus，型號IX3-RFACS）下拍照。Nissl 染色：在400 倍光鏡下，在DG 顆粒細(xì)胞層、CA3 區(qū)和CA1 區(qū)分別選3 個連續(xù)視野拍攝，在齒狀回門區(qū)（dentate hilus，DH）選2 個連續(xù)視野拍攝；用Image J 軟件測量顆粒細(xì)胞層在視野中的面積占比；在CA3 區(qū)及CA1 區(qū)計數(shù)錐體細(xì)胞，在DH 計數(shù)多形細(xì)胞。Timm 染色：在400 倍光鏡下的DG 顆粒細(xì)胞層及內(nèi)側(cè)分子層交界處選4 個連續(xù)視野拍攝；用Image J 軟件將圖像轉(zhuǎn)換為8-bit，校正光密度后測量內(nèi)側(cè)分子層中MFS 的平均光密度。

1.5 Western-blot 法檢測 在液氮中研磨新鮮海馬結(jié)構(gòu)組織后加入RIPA 裂解液（Thermo，批號SF249254），經(jīng)離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）后留取上清并行蛋白定量（Bio-world，BCA 定量試劑盒，批 號9802334）。取500 μL 樣 品 混合125 μL loading buffer 后加熱（70 ℃，10 min）。向每孔加樣后用電泳儀（Bio-rad，型號1645052）跑膠：SDS-PAGE 濃縮膠（5%）恒壓80 V-20 min，分離膠（15%，8%）120 V-1 h。轉(zhuǎn) 膜：BDNF 用0.4A 恒 流 轉(zhuǎn)45 min；Trk-B 用0.4A 恒流轉(zhuǎn)1 h。取膜后用5%脫脂牛奶在常溫封閉1 h 后，加入一抗在4 ℃孵育過夜，其中BDNF（1:1 000；北京博奧森，批號AH02263758）、Trk-B（1:5 000；上海艾博抗，批號GR308211-2）和β-actin（1:5 000；北京博奧森，批號AH01032107）。洗膜。隨后用帶有熒光素標(biāo)記的二抗在常溫下孵1 h，洗膜。將條帶放到熒光成像系統(tǒng)（Odyssey Fc-LI-COR 顯色儀）中顯影及拍攝，用Image J 軟件分析條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；組間比較呈正態(tài)分布者進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Games-Howell 檢驗；非正態(tài)分布者進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗。計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 半夏生物總堿對空間工作記憶能力及自主活動量的影響 見表1、表2。第2 次測試時，正常對照組FAB%為94.12%（16/17），與之比較，癲癇對照組（75%，9/12）、PTA 高劑量組（66.67%，8/12）、PTA 低劑量組（50%，5/10）和托吡酯組（50%，5/10）的FAB%較低（各P＜0.05）。

表1 PTA 對FAT-目標(biāo)臂停留時間的影響（）

表1 PTA 對FAT-目標(biāo)臂停留時間的影響（）

注：第1 次測試時PTA 低劑量組和第2 次測試時癲癇對照組分別剔除1 只大鼠。同一行，與第1 次測試比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 5 組大鼠第2 次行為學(xué)測試指標(biāo)組間比較（）

表2 5 組大鼠第2 次行為學(xué)測試指標(biāo)組間比較（）

注：同一列，與正常對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；與托吡酯組比較，△△P ＜0.01

2.2 半夏生物總堿對海馬結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)病變的影響 見表3、圖1。與正常對照組比較，癲癇對照組CA3 區(qū)、CA1 區(qū)及DH 的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，形態(tài)腫脹、排列紊亂，Nissl 小體減少；DG 見層狀分布的、深染色的苔蘚纖維發(fā)芽，在局部交織成片或深入內(nèi)側(cè)分子層。

圖1 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)病變的影響（×400）

表3 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)病變的影響（）

表3 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)病變的影響（）

注：同一列，與正常對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；與癲癇對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與托吡酯組比較，▲▲▲P ＜0.001；與PTA 低劑量組比較，□□P ＜0.01

2.3 半夏生物總堿對海馬結(jié)構(gòu)BDNF 及Trk-B 蛋白表達(dá)量的影響 見表4、圖2。

圖2 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達(dá)量的影響

表4 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達(dá)量的影響（，n =5）

表4 PTA 對海馬結(jié)構(gòu)mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達(dá)量的影響（，n =5）

注：同一列，與正常對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 討論

癲癇大鼠OFL“進(jìn)入格數(shù)”顯著增加反映過度活動，F(xiàn)AB%及SAB%顯著降低反映空間工作記憶障礙，F(xiàn)AT“目標(biāo)臂停留時間”縮短和OFL“中心停留時間”延長反映對陌生環(huán)境的適應(yīng)能力下降。半夏生物總堿及托吡酯對過度活動的改善不顯著，但半夏生物總堿0.4 g/kg 可在一定程度上提高SAB%、縮短“中心停留時間”，而半夏生物總堿 0.8 g/kg 可延長“目標(biāo)臂停留時間”。典型的海馬硬化表現(xiàn)為CA3 區(qū)、CA1 區(qū)和DH 的神經(jīng)元減損，而DG 和CA2 區(qū)的神經(jīng)元相對保留[11]。正常的苔蘚纖維從DG 的顆粒細(xì)胞發(fā)出，連接DH的苔蘚細(xì)胞和海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)的錐體細(xì)胞。在癲癇大腦中，DG 顆粒細(xì)胞的神經(jīng)新生異?；钴S，長出形態(tài)、分布及功能異常的苔蘚纖維，形成異常投射環(huán)路，即所謂苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象[12]。以上2 種病變易化癇性放電的產(chǎn)生及傳遞，并與癲癇合并癥發(fā)病有關(guān)。半夏生物總堿 0.8 g/kg 對CA3 區(qū)及DH 的神經(jīng)元減損存在顯著的保護(hù)作用，而半夏生物總堿 0.4 g/kg及0.8 g/kg 和托吡酯均對苔蘚纖維發(fā)芽存在顯著的抑制作用。哺乳類動物的大腦中有兩種BDNF 異構(gòu)體，即proBDNF 及由其裂解而成的mBDNF。mBDNF 的受體為Trk-B，功能與神經(jīng)元存活、突觸可塑性和記憶功能有關(guān)。BDNF 和Trk-B 可通過以下機(jī)制加重癲癇病情：BDNF 結(jié)合Trk-B 后提高海馬結(jié)構(gòu)的興奮性并促進(jìn)DG神經(jīng)新生；BDNF 增強(qiáng)谷氨酸能傳導(dǎo)、下調(diào)K+-Cl-同向轉(zhuǎn)運體功能、直接抑制γ-氨基丁酸受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流，即弱化γ-氨基丁酸能系統(tǒng)功能[13-14]。半夏生物總堿及托吡酯顯著降低mBDNF 的蛋白表達(dá)量，而半夏生物總堿對proBDNF 和Trk-B 的蛋白表達(dá)量也可能存在降低作用。

綜上所述，半夏生物總堿對PILO 癲癇模型存在治療作用，表現(xiàn)為改善空間工作記憶障礙、顯著抑制海馬硬化和苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象及顯著降低海馬結(jié)構(gòu)中mBDNF 的蛋白表達(dá)量；半夏生物總堿還可能降低海馬結(jié)構(gòu)中proBDNF 和Trk-B 的蛋白表達(dá)量。